一种提高黑色素产率的基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种提高黑色素产率的基因，该基因是将基因

A gene for improving the yield of melanin and its application

The invention discloses a gene for improving the yield of melanin. The gene is a gene.

【技术实现步骤摘要】
一种提高黑色素产率的基因及其应用
本专利技术涉及基因工程
，具体地说是一种提高黑色素产率的基因及其应用。
技术介绍
黑色素（Melanin）是一类分子结构未知的高分子量黑色色素类物质，广泛存在于动物、植物和微生物体中，其结构复杂多样，能提高生物生存、竞争的能力。黑色素是一种生物大分子，难溶于水，不溶于大部分有机溶剂和酸液。黑色素的结构非常复杂，到目前为止，行业内的研究人员仍然对其缺乏全面、清楚的认识。据研究表明，黑色素的基础结构是一些共价交联的吲哚环，而且不同生物体产生的黑色素的结构也各不相同。一般来讲，黑色素分为四种类型，分别是真黑素（eumelanin）、棕黑素（phaeomelanin）、异黑素（allomelanin）和脓黑素（pyomelanin）。随着研究的深入，人们发现天然黑色素有着非常强大的功能，其具有抗氧化、防止衰老、防止紫外线辐射等，因此，人们可以利用天然黑色素制备各种功能性日用化妆品，如防晒膏、防晒霜、染发剂等，也可以将其作为酒类、饮料类、婴儿保健品及大众食品的添加剂研制出各种保健食品。另外，人们研究发现天然黑色素还与某些疾病，衰老，肤色等有关，如近年来，人们发现一些可溶性黑色素在体外对艾滋病病毒有显著的抑制作用，因此，天然黑色素将来有可能成为一种新的抗艾滋病药物。此外，天然黑色素还可以作为一种生物半导体材料应用。由于天然色素与人工合成色素相比具有安全、无毒、营养价值高等优点，这就促使人们更多地获得天然色素。目前，天然色素主要是从动物、植物和微生物中提取。其中从动植物中提取的色素成本高，应用受到一定局限，而利用微生物生产天然色素，不仅可以克服动植物为原料生产天然色素的很多缺点，并且易于工业化。目前，人们已发现多种微生物可以用来生产色素，如将类胡萝卜素在大肠杆菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母和运动发酵单孢菌中进行生产；如Minra等将欧氏杆菌中控制番茄红素合成的基因转入产蛋白假丝酵母，得到番茄红素和八氢番茄红素；如阮丽芳等将嗜麦芽假单胞菌中产黑色素mel基因克隆到穿梭载体pHT3101中，将构建的重组质粒pHTAM转入苏云金芽胞杆菌受体菌株BMB171中，得到重组菌株RSA，mel基因得到成功表达；如从Streptomycesavermitilis克隆得到的一段基因HPDs在大肠杆菌中表达，并在发酵液中发现产生一种由尿黑酸氧化聚合而产生的色素；又如Steven等将海洋细菌ShewanellacolwellianD的hppd基因克隆到大肠杆菌中发酵产生脓黑素；Keon从Mycosphaerellagraminicola中分离出hppd基因并克隆到大肠杆菌中，在发酵液中得到脓黑素；也如姚红宝在硕士论文中公开了将黄连hppd基因在大肠杆菌中进行原核表达，重组菌的表达产物hppd催化对羟苯基丙酮酸氧化形成尿黑酸，尿黑酸暴露在氧气中时发生氧化聚合形成一种褐色色素-脓黑素。虽然现有研究已经通过转入特定基因的工程菌来生产黑色素，但是，我们发现这些研究中的生产黑色素的产量相对偏低。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种提高黑色素产率的基因及其应用，为生产黑色素提供了一种高效的生产途径。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种提高黑色素产率的基因，该基因是将基因Cjhppd的编码蛋白的氨基酸序列的第280位的Tyr突变成Phe，命名为CjhppdY280F，基因CjhppdY280F的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。其中基因Cjhppd的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；所述基因Cjhppd的编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。一种核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的提高黑色素产率的基因所编码蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。一种含有核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的提高黑色素产率的基因的质粒，所述质粒为pET21d-CjhppdY280F；所述质粒中的基因处于T7表达框架的调控之下。一种含有核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的提高黑色素产率的基因的工程菌株，即将质粒pET21d-CjhppdY280F转入到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞得到的重组菌株。本专利技术还公开了如SEQIDNO:1所示的提高黑色素产率的基因在生产黑色素中的应用，其具体的应用方法是：将基因CjhppdY280F连接到质粒载体上，导入大肠杆菌菌株中，获得能够产生黑色素的重组菌，活化培养，诱导表达使其产生黑色素，分离提取，获得黑色素。所述质粒载体为pET21d，所述大肠杆菌菌株为BL21（DE3）。所述诱导表达是指将重组菌活化后，按体积比为1:50的比例接种于装有50mL的LB液体发酵培养基（附加100μg/mL氨苄青霉素）的250mL三角瓶中，220r/min转速，37℃下振荡培养；当培养液菌浓度达到A600≈0.6时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，培养温度调整到30℃，诱导重组hppd酶蛋白表达，继续培养重组菌产生色素，48h后停止发酵。本专利技术通过分子生物学方法将基因Cjhppd的编码蛋白的氨基酸序列中280位由原来的酪氨酸（Tyr,Y）突变成苯丙氨酸（Phe,F），将突变后的基因CjhppdY280F连接到质粒上并转入大肠杆菌内，获得了与基因Cjhppd相似的的表达载体和重组菌，通过诱导表达产生黑色素，特别地，在研究过程中意外发现突变后的基因CjhppdY280F较突变前能够显著提高黑色素的产量；而且突变后的基因CjhppdY280F产生的黑色素与突变前基因Cjhppd产生的黑色素属于相同的脓黑素，且同样在光照和温度变化条件下以及外加氧化剂和还原剂的条件下保持稳定的特性；且添加物蔗糖、葡萄糖不影响色素的稳定性；对细菌具有紫外线保护作用，并且具有抗氧化及可能的酶蛋白活性保护作用。将本专利技术提供的基因CjhppdY280F应用于生产脓黑素，具有方法简单、生产成本低，生产周期短、产量高、可以控制等优点，且生产的脓黑素为天然黑色素，不需要动、植物原材料，与人工合成黑色素相比有无毒、安全等优势。本专利技术生产的黑色素可以用于保健食品工业、日用化妆品工业，制备防晒膏、防晒霜和黑发剂洗护工业以及生物菌肥的菌体保护和酶制剂等领域。附图说明图1为实施例1和对比例1得到的重组菌株所生产的黑色素的傅里叶红外光谱图。图2为实施例4制作的黑色素的质量浓度与OD值关系的标准曲线。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例所使用的部分培养基、母液配方如下：LB液体基本培养基：NaCl10g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L，pH＝7.0。若为固体培养需在LB液体基本培养基中再加琼脂15g/L即可。LB液体发酵培养基：LB液体基本培养基+1g/L的L-酪氨酸。氨苄青霉素母液（100mg/mL）：溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的灭菌水中，最后定容至10mL，用0.22μm滤膜过滤除菌。实施例11、突变：采用北京全式金生物技术公司FastMutagenesisSystem进行，以重组质粒pET21d-Cjhppd为目标质粒，设计突变位点，将基因Cjhppd的编码蛋白的氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高黑色素产率的基因，其特征在于，该基因是将基因

【技术特征摘要】
1.一种提高黑色素产率的基因，其特征在于，该基因是将基因Cjhppd的编码蛋白的氨基酸序列的第280位的Tyr突变成Phe，命名为CjhppdY280F，基因CjhppdY280F的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.根据权利要求1所述的提高黑色素产率的基因，其特征在于，所述基因Cjhppd的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；所述基因Cjhppd的编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。3.一种权利要求1所述的提高黑色素产率的基因所编码蛋白，...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁玉玲，卢振，刘振，
申请(专利权)人：河北大学，
类型：发明
国别省市：河北,13