桑树黑斑病病原菌的核糖体RNA序列及其应用制造技术

本发明专利技术首次公开了一种桑树黑斑病病原菌

Ribosomal RNA sequences of pathogenic bacteria and its application in mulberry leaf spot

For the first time, the invention discloses a mulberry leaf spot pathogen

【技术实现步骤摘要】
桑树黑斑病病原菌的核糖体RNA序列及其应用
本专利技术属于生物
，特别涉及一种桑树黑斑病病原Pseudocercosporamori的核糖体RNA序列及其应用。
技术介绍
现有的真菌研究方法中，常常通过核糖体DNA(ribosomeDNA,rDNA)序列进行测序比对用于真菌的鉴定。核糖体在细胞中具有重要功能，rDNA编码的基因许多都与蛋白质合成的反应过程密切相关，在蛋白质的生物合成中起决定作用。rDNA序列分为转录区和非转录区，转录区由编码核糖体5.8S、18S、28S蛋白结构的基因和基因间的2个转录间隔区(InternalTranscribedSpacer,ITS)ITS1、和ITS2组成，共同组成一个转录单位。rDNA中编码5.8S、18S、28S的rDNA序列较为保守，可以用于分析自然界物种分类的科间或更高级阶元间的血系研究的分子标记。由于5.8SrDNA序列短、且高度保守，难以用于真菌的系统发育和分子鉴定；而18SrDNA的片段较长，片段中存在保守区和可变区，因此，现有研究中，通过选择不同的特异性扩增引物将某一结构域片段扩增后，经过测序以及对测序结果的分析比对，可用于真菌目、科、属等分类阶元的研究。但是，基于5.8S、18S、28S的rDNA序列难以全面反映对真菌种属分类的分子特征，甚至不能有效地确定病原真菌的种属，而往往采用ITS序列来进行种(species)水平的鉴别。然而ITS区段的高变异性，在应用中出现了许多问题，因此，利用转录组学的技术获得rRNA的全长序列，把各基因区域的优缺点整合起来，进行真菌物种的分类和鉴定研究是现代生物技术发展的必然选择。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是弥补现有技术的空白，提供一种桑树黑斑病病原菌Pseudocercosporamori的核糖体RNA的全长cDNA序列。本专利技术的另一个目的在于提供桑树黑斑病病原菌Pseudocercosporamori的核糖体RNA序列在定量检测桑树黑斑病病原菌Pseudocercosporamori的应用。本专利技术的再一目的在于提供桑树黑斑病病原菌Pseudocercosporamori的核糖体RNA序列在定量检测桑树黑斑病病原菌Pseudocercosporamori应用的方法。本专利技术的还有一个目的在于提供桑树黑斑病病原菌Pseudocercosporamori的核糖体RNA序列在真菌种属分类方面的应用。本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现：本专利技术提供了一种桑树黑斑病病原菌Pseudocercosporamori核糖体RNA的全长cDNA序列，如SEQ.ID.NO1所示。所述核糖体RNA由18SrRNA、ITS1、5.8SrRNA、ITS2、28SrRNA组成；所述18SrRNA的cDNA序列为SEQ.ID.NO1所示序列中第1～1726碱基序列所示；所示ITS1的cDNA序列为SEQ.ID.NO1所示序列中第1727～1876，所述5.8SrRNA的cDNA序列为SEQ.ID.NO1所示序列中第1877～2034，所述ITS2的cDNA序列为SEQ.ID.NO1所示序列中第2035～2183，所述28SrRNA的cDNA序列为SEQ.ID.NO1所示序列中第2184～5469。所述核糖体RNA的全长cDNA序列中包含2对引物序列，所述引物序列分别如SEQ.ID.NO2～SEQ.ID.NO5所示。本专利技术还提供了所述桑树黑斑病病原菌Pseudocercosporamori核糖体RNA的cDNA序列在定量检测桑树黑斑病病原菌Pseudocercosporamori的应用。本专利技术还提供了所述桑树黑斑病病原菌Pseudocercosporamori核糖体RNA的cDNA序列在定量检测桑树黑斑病病原菌Pseudocercosporamori应用的方法，包括以下步骤：S1.收集桑树病叶；S2.提取桑树病叶的总DNA；S3.IlluminaDNA文库构建；S4.Illumina高通量测序；S5.去除测序数据中桑树基因组序列；S6.组装微生物基因组序列；S7.组装完整核糖体DNA序列；S8.对比分析核糖体DNA序列；步骤S3所述IlluminaDNA文库构建的方法为：依照Illumina文库构建流程，将所述步骤S2中所述总DNA构建为片段大小500bp的双末端高通量测序文库；步骤S5所述去除测序数据中桑树基因组序列的方法为：利用比对软件对步骤S4中所述高通量测序数据进行数据比对分析。选择比对算法，将所述测序数据与桑树参考基因组进行比对，并将比对上参考基因组的所述测序数据判定为桑树基因组序列。使用编写的计算机程序从所述测序数据中去除桑树基因组序列。S5所述去除桑树的基因组DNA序列选用的参考基因组序列为：桑属(Morusnotabilis)全基因组序列(GCA_000414095.2)和叶绿体基因组序列(NC_027110.1)。优选地，所述比对软件为bwa(0.7.12-r1039)软件；优选地，所述比对算法为mem比对算法；优选地，所述将测序数据与桑树参考基因组进行比对选用的是双末端比对方法和bwa(0.7.12-r1039)软件的默认参数；优选地，所述编写的计算机程序是用python计算机语言编写。步骤S6所述组装微生物基因组序列的方法为：使用组装软件对步骤S5所述已去除桑树基因组序列的测序数据进行组装。优选地，所述组装软件为MetaVelvet(v1.2.01)。步骤S7所述组装完整核糖体DNA序列的方法为：采用比对软件，对所述组装序列进行比对，根据比对结果从测序数据中获取双末端测序片段，使用组装软件对序列进行组装和延伸，经多个循环操作，直至获得完整的核糖体DNA序列；优选地，所述比对软件为bwa(0.7.12-r1039)软件；优选地，所述比对方法采用无错配0mismatch和无断裂0gap比对；优选地，所述组装软件为MetaVelvet(v1.2.01)软件。本专利技术的还提供了桑树黑斑病病原菌Pseudocercosporamori的核糖体RNA的cDNA序列在真菌种属分类方面的应用。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术首次提供了所述桑树黑斑病病原菌Pseudocercosporamori的核糖体RNA的cDNA序列，基于所述序列建立了一种新的真菌种属分类方法，尤其是在定量检测桑树黑斑病病原菌Pseudocercosporamori具有良好的应用。附图说明图1验证核糖体组装结果的两对引物与通用引物ITS1/ITS4电泳图。图2桑叶黑斑叶片所检测到的真菌微生物分类树。图3验证用特异的引物序列用于桑树污叶病的病原PCR检测和鉴定结果。具体实施方式下面结合具体实施例进一步说明本专利技术的应用方法。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本专利技术的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的生化试剂原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。实施例1在发病的桑园随机寻找到的具有典型黑斑病病斑的叶片，收集，剪取桑叶中的病斑区域，剪下的病斑材料使用液氮充分研磨，提取桑树病叶的总RNA；提取的总RNA贮存于-80℃。将总RNA反转录成cDNA文库；设计引物序列和通用引物序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种桑树黑斑病病原菌

【技术特征摘要】
1.一种桑树黑斑病病原菌Pseudocercosporamori核糖体RNA，其特征在于，所述核糖体RNA的全长cDNA序列如SEQ.ID.NO1所示。2.根据权利要求1所述桑树黑斑病病原菌Pseudocercosporamori核糖体RNA，其特征在于，所述核糖体RNA由18SrRNA、ITS1、5.8SrRNA、ITS2、28SrRNA组成；所述18SrRNA的cDNA序列为SEQ.ID.NO1所示序列中第1～1726碱基序列所示；所示ITS1的cDNA序列为SEQ.ID.NO1所示序列中第1727～1876，所述5.8SrRNA的cDNA序列为SEQ.ID.NO1所示序列中第1877～2034，所述ITS2的cDNA序列为SEQ.ID.NO1所示序列中第2035～2183，所述28SrRNA的cDNA序列为SEQ.ID.NO1所示序列中第2184～5469。3.根据权利要求1所述桑树黑斑病病原菌Pseudocercosporamori核糖体RNA，其特征在于，所述核糖体RNA的全长cDNA序列中包含2对引物序列，所述引物序列分别如SEQ.ID.NO2～SEQ.ID.NO5所示。4.根据权利要求1或2所述桑树黑斑病病原菌Pseudocercosporamori的核糖体RNA序列在定量检测桑树黑斑病病原菌Pseudocercosporamori的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用的方法包括以下步骤：S1.收集桑树病叶；S2.提取桑树病叶的总DNA；S3.IlluminaDNA文库构建；S4.Illumina高通量测序；S5.去除测序数据中桑树基因组序列；S6.组装微生物基因组序列；S7.组装完整核糖体DNA序列S8.对比分析核糖体DNA序列；步骤S3所述IlluminaDNA文库构建的方法为：依照Illumina文库构建流程，将所述步骤S2中所述总DNA构建为片段大小500bp的双末端高通量测序文库；步骤S9所述对对比分析核糖体DNA序...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘吉平，刘希，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44