一种微藻培养方法技术

本发明专利技术公开了一种通过控制葡萄糖浓度，有效提高微藻生物量和底物转化率的异养培养方法，该培养方法采用连续补料方式，根据葡萄糖浓度的变化适时调整补料速度，将整个培养过程中的葡萄糖浓度控制在较为稳定的水平(变化幅度小于或等于5g/L)。该方法相较于目前应用最为广泛的葡萄糖浓度变化过于剧烈的脉冲式补料方式，微藻最高生物量浓度和底物转化率得到显著提高，使相同生物量浓度下的培养时间大大缩短。

A microalgae culture method

The invention discloses a glucose control through, effectively improve the microalgae biomass and substrate conversion rate of heterotrophic cultivation method, the cultivation method by continuous feeding method, adjust the feeding speed according to the change of glucose concentration, the whole process of cultivation of glucose concentration was controlled at relatively stable levels (range changes less than or equal to 5g/L). Compared with the most widely applied pulse feeding mode with excessive glucose concentration, the method has significantly improved the highest biomass concentration and substrate conversion rate of microalgae, greatly reducing the incubation time under the same biomass concentration.

【技术实现步骤摘要】
一种微藻培养方法
本专利技术属于生物工程
，涉及一种微藻异养培养方法，其中通过稳定葡萄糖浓度而有效提高生物量和底物转化率。
技术介绍
微藻因其富含蛋白质、脂类、多糖、维生素、抗氧化剂和其它功能性营养成分，在医药原料、保健食品及生物能源领域具有广泛的应用。目前，微藻培养技术多集中于光自养体系，该培养体系存在生产效率低、占地面积大、收获成本高等不足，严重制约了微藻产业的发展。通过人工大规模培养技术提高微藻生物量是微藻资源开发利用的关键。近年来，逐渐兴起了微藻异养高细胞密度培养技术，该技术可以克服光培养体系对光的限制，具有生长速度更快、能实现纯种培养、细胞产率高、便于自动化控制等优势，已成为近年来微藻培养研究的热点。本领域需要一种高效的微藻异养高密度培养方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种微藻例如栅藻的异养培养方法，所述方法包括在培养过程中使培养物中碳源浓度的变化幅度小于或等于大约5g/L。通过本专利技术的方法，有效地提高微藻例如栅藻的生物量和底物转化率，且无需额外调节pH值。附图说明图1示出目前普遍使用的脉冲式补料方式(对照组)下葡萄糖浓度随时间变化情况。在此补料方式下，葡萄糖浓度在0-20g/L的范围内剧烈波动。图2为采用本专利技术所采用的补料方式下葡萄糖浓度随时间变化情况。在此补料方式下，根据葡萄糖浓度的适时测量，及时调整补料速度，将葡萄糖浓度分别控制在三个不同的小范围内。图3为对照组和3个实验组下生物量浓度随时间变化的比较。采用本专利技术所采用的补料方式的各实验组的最高生物量浓度明显高于对照组，且Experiment1和Experiment2下同期的生物量浓度明显高于对照组，因此在获得相同的生物量下的培养时间大大缩短。专利技术详述本专利技术提供一种微藻异养培养方法，所述方法包括在培养过程中使培养物中碳源浓度的变化幅度小于或等于大约5g/L。在本专利技术中“碳源浓度的变化幅度小于或等于大约5g/L”指的是任意两次测量所得的碳源浓度之间的差值小于或等于大约5g/L。在本专利技术的方法的一些实施方案中，通过连续补料的方式添加碳源，例如通过阶段式恒速流加方式添加碳源。在一些实施方案中，在培养过程中大约每0.5-3小时测量培养物中的碳源浓度，并根据测得的碳源浓度调整补料速度，从而使碳源浓度的变化幅度小于或等于大约5g/L。在一些实施方案中，所述补料速度为大约5g/小时-大约1000g/小时。本领域技术人员可以根据测得的碳源浓度以及培养物的体积调节所述补料速度。例如，与培养体积相关的所述补料速度可选自大约0.5g/L/h-大约25g/L/h的范围。在一些实施方案中，所述碳源是葡萄糖。在一些实施方案中，所述微藻选自小球藻(Chlorella)、眼虫藻(Euglenagracilis)、栅藻(Scenedesmus)、扁藻(Tetraselmisgracilis)、菱形藻(Nitzschia)、富油新绿藻(Neochlorisoleoabundans)、微拟球藻(Nannochloropsis)、杜氏藻(Dunaliella)。在一具体实施方案中，所述微藻是尖状栅藻(Scenedesmusacuminatus)。在一些实施方案中，所述微藻的初始接种量为大约5-20％(v/v)，例如大约5％(v/v)、大约10％(v/v)、大约15％(v/v)或大约20％(v/v)。在一些实施方案中，接种后的初始细胞干重为大约0.5g/L-大约5g/L。在一些实施方案中，所述培养在大约25-40℃下进行。对于栅藻，例如尖状栅藻，优选所述培养在30℃±2℃下进行。在一些实施方案中，所述培养在大约10-60％，例如10％、20％、30％、40％、50％或60％的溶氧浓度下进行。在本专利技术中，“溶氧浓度”是指培养基中所溶解的氧的量相对于培养条件下培养基中氧的饱和溶解度的百分比。溶氧浓度控制方法是溶氧转速、氧气偶联。具体而言，溶氧转速、氧气偶联的控制方法是：当培养物中的溶氧值低于设定值时通过自动增加搅拌转速，来提高通入气体中氧气在培养物中的溶解，当转速增加至设定最大值而溶氧浓度仍低于设定值时，再通过增加通气(空气和氧气的混合气体)中氧气的比例，来增加溶氧；当培养物中的溶氧浓度高于设定值时通过自动降低通气中氧气的比例，来降低溶氧；当氧气比例降至0，通100％空气时，溶氧浓度仍高于设定值时，再通过自动降低搅拌转速方式进一步降低溶氧浓度，直至降至设定值。在一些实施方案中，所述培养的初始碳源浓度为大约5-40g/L，例如大约5g/L、大约10g/L、大约15g/L、大约20g/L、大约25g/L、大约30g/L、大约35g/L或大约40g/L。在一些实施方案中，所述培养过程的碳源浓度被控制在以下范围：大约0-5g/L、大约5-10g/L、大约10-15g/L、大约15-20g/L、大约20-25g/L、大约25-30g/L或大约35-40g/L。在一些实施方案中，所述培养在大约5-100000L的生物反应器如发酵罐中进行。相应地，所述培养物的初始体积可以为大约2-40000L。在一些实施方案中，所述方法中使用如表2和表3中所示的培养基。脉冲式补料方式是现有技术中微藻异养高密度培养过程中应用最为广泛的一种基质流加方式，已广泛应用于小球藻[1-4]和眼虫藻[5]等的高密度培养。脉冲式补料是在整个异养培养周期(>150h)中，当测到葡萄糖消耗殆尽时，然后短时间内加入大量葡萄糖，在整个培养过程中只会加3-5次料。本专利技术人发现该补料方式可能存在如下缺点(不受任何已知理论限制)：1)补料阶段的基质浓度呈脉冲式变化，补料时基质浓度瞬时波动较大，造成细胞的增殖速度低；2)短时间内基质的大量添加导致细胞对氧的需求也急剧增加，进而造成发酵过程中氧的瞬间供应不足和抑制性代谢副产物(如乙醇或乙酸)的生成；3)培养过程中的pH会因补料液的大量加入而急剧变化，造成不必要的酸或碱的添加，从而增加了额外的酸碱调节设备和成本。本专利技术人令人惊奇地发现，采用本专利技术的方法，通过适时检测碳源浓度并结合调节流加速度大小，可以有效控制培养过程中碳源浓度的变化幅度，从而避免脉冲式补料方式下碳源浓度短时间大幅波动对细胞生长的抑制作用，使得细胞的生长速度更快，最高细胞浓度更高，底物的转化率也更高。本专利技术整个流加培养过程中无需通过碱液调控pH，省掉供碱装置和碱液的供应成本。在一个具体的方面，本专利技术提供了一种异养培养栅藻，例如尖状栅藻的方法，所述方法包括以下步骤：a)将栅藻接种于包含固体活化培养基上，在光强30～50μmolm-2s-1，25℃±2℃下培养15-20天；b)挑取步骤a)中获得的栅藻至液体一级种子培养基中，在30℃±2℃下以大约150-220rpm的转速培养120-144小时或培养至OD750＝8-12；c)将步骤b)中获得的栅藻以大约5-20％(v/v)的接种量接种于液体二级种子培养基中，在30℃±2℃下以大约150-220rpm的转速培养72-84小时或培养至OD750＝16-20；d)将步骤c)中获得的栅藻以大约5-20％(v/v)的接种量接种于液体三级种子培养基中，在30℃±2℃下以大约150-220rpm的转速培养72-84小时或培养至OD750＝20-22；e)将步骤c)中获得的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微藻异养培养方法，所述方法包括在培养过程中使培养物中碳源浓度的变化幅度小于或等于大约5g/L。

【技术特征摘要】
1.一种微藻异养培养方法，所述方法包括在培养过程中使培养物中碳源浓度的变化幅度小于或等于大约5g/L。2.权利要求1的方法，其中在培养过程中通过连续补料的方式添加碳源，例如通过阶段式恒速流加方式添加碳源。3.权利要求2的方法，其中在培养过程中大约每0.5-3小时测量培养物中的碳源浓度，并根据测得的碳源浓度调整补料速度，从而使碳源浓度的变化幅度小于或等于大约5g/L。4.权利要求3的方法，所述补料速度为大约0.5g/L/h-大约25g/L/h。5.权利要求1-4中任一项的方法，所述碳源是葡萄糖。6.权利要求1-5中任一项的方法，所述微藻选自小球藻(Chlorella)、眼虫藻(Euglenagracilis)、栅藻(Scenedesmus)、扁藻(Tetraselmisgracilis)、菱形藻(Nitzschia)、富油新绿藻(Neochlorisoleoabundans)、微拟球藻(Nannochloropsis)、杜氏藻(Dunaliella)。7.权利要求1-5中任一项的方法，所述微藻是尖状栅藻(Scenedesmusacuminatus)。8.权利要求1-5中任一项的方法，所述微藻的初始接种量为大约5-20％(v/v)，例如大约5％(v/v)、大约10％(v/v)、大约15％(v/v)或大约20％(v/v)。9.权利要求1-5中任一项的方法，所述微藻接种后的初始细胞干重为大约0.5g/L-大约5g/L。10.权利要求1-5中任一项的方法，所述培养在大约25-40℃下进行。11.权利要求1-5中任一项的方法，所述培养在大约10-60％，例如10％、20％、30％、40％、50％或60％的溶氧浓度下进行。12.权利要求1-5中任一项的方法，所述培养的初始碳源浓度为大约5-40g/L，例如大约5g/L、大约10g/L、大约15g/L、大约20g/L、大约2...

【专利技术属性】
技术研发人员：金虎，韩丹翔，李坤朋，张虎，侯国立，徐全，胡强，
申请(专利权)人：国家开发投资公司，中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11