用气单胞菌氨肽酶由多肽除去N末端丙氨酸残基的方法技术

本发明专利技术描述了使用由海洋细菌解蛋白气单胞菌衍生的氨肽酶，由多肽（优选重组蛋白质）除去Ｎ末端丙氨酸残基的方法。因此，气单胞菌氨肽酶（ＡＡＰ；Ｅ．Ｃ．３．４．１１．１０）可以用于（例如）由人生长激素（ｈＳＴ或ｈＧＨ）、猪生长激素（ｐＳＴ）、和牛生长激素（ｂＳＴ）的衍生物除去Ｎ末端丙氨酰基残基，从而产生具有其天然氨基酸序列的蛋白质。可以在自由的溶液中进行酶反应，或者可以将ＡＡＰ固定在固相支持物上，用于在体外进行反应。用于（例如）将Ａｌａ－ｈＧＨ转变成ｈＧＨ的有效方法包括：在大肠杆菌中表达Ａｌａ－ｈＧＨ，回收包涵体，在去污剂中溶解并重新折叠，通过超滤除去去污剂，选择性沉淀，酶切割，然后进行两个柱层析步骤。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术描述了使用由海洋细菌解蛋白气单胞菌(Aeromonasproteolytica)衍生的氨肽酶，由多肽(优选重组蛋白质)除去N末端丙氨酸残基的方法。由此，气单胞菌氨肽酶(APP；E.C.3.4.11.10)可以用于(例如)由人生长激素(hST或hGH)、猪生长激素(pST)、和牛生长激素(bST)的衍生物除去N末端丙氨酰基残基，从而产生具有天然氨基酸序列的蛋白质。可以在自由的溶液中进行酶反应，或者可以将AAP固定在固相支持物上，用于在体外进行反应。用于(例如)将Ala-hGH转变成hGH的有效方法包括在大肠杆菌中表达Ala-hGH，回收包涵体，在去污剂中溶解并重新折叠，通过超滤除去去污剂，选择性沉淀，酶切割，然后进行两种柱层析步骤。
技术介绍
非常需要模拟或具有天然蛋白质相同结构的重组蛋白质，这些重组蛋白质可用于治疗性应用，作为疫苗和诊断性检验试剂盒的成分，以及作为结构/功能研究的试剂。一般使用哺乳动物、细菌、和昆虫的细胞来表达用于这些应用的重组蛋白质。然而，当需要大量蛋白质用于实验性或临床性研究时，而且蛋白质能够重新折叠成正确构象，一般使用细菌表达系统。具体而言，当最终的蛋白质产物不要求或不需要真核细胞的翻译后修饰(如糖基化)时，细菌系统与其它表达载体系统相比提供了显著的成本优势。在细菌(诸如大肠杆菌)中表达的重组蛋白质常常隔绝在不溶性包涵体中。由包涵体收获的异源蛋白质常常保留额外的氨基酸残基，诸如位于氨基末端的甲硫氨酸。然而，由真核宿主细胞收获的天然或重组蛋白质常常不存在由ATG起始密码子编码的这一甲硫氨酸。然而，在大肠杆菌细胞质中产生的许多蛋白质的氨基末端受到酶的加工，诸如甲硫氨酸氨肽酶(Ben Bassat等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)169751-757，1987)，使得表达后一般由N末端切除甲硫氨酸。蛋白质末端的氨基酸组成以许多不同方式存在差异(Berezovsky等人，蛋白质工程(Protein Engineering)12(1)23-30，1999)。N-外肽酶活性的系统检验导致了“N末端规则”的发现若下一个氨基酸是Ala、Cys、Gly、Pro、Ser、Thr、或Val，则切除N末端(f)Met；若下一个氨基酸是Arg、Asp、Asn、Glu、Gln、Ile、Leu、Lys、或Met，则起始(f)Met仍然作为成熟蛋白质的第一个氨基酸。有人提出氨基酸侧链的水合半径是这些发现的物理学基础(Bachmain等人，科学(Science)234179-186，1986；Varshavsky，细胞(Cell)69725-735，1992)。蛋白质半衰期(3分钟-20小时)受到N末端氨基酸化学结构的显著影响(Stewart等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)27025-28，1995；Griegoryev等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)27128521-28532，1996)。随后使用定点诱变来确认‘N末端规则”，即监测改变了N末端氨基酸序列的重组蛋白质的寿命(Varshavsky，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Aead.Sci.USA)9312142-12149，1996)。蛋白质N末端氨基酸序列的统计学分析提出，Met和Ala残基过度展示于第1位，而第+2位和第+5位优选Thr(Berezovsky等人，蛋白质工程(Protein Engineering)12(1)23-30，1999)。然而，C末端偏倚显示，优选带电荷的氨基酸和Cys残基(Berezovsky等人，蛋白质工程(Protein Engineering)12(1)23-30，1999)。在有些情况中，保留N末端甲硫氨酸的重组蛋白质的生物学特征与不含N末端甲硫氨酸的天然种类不同。例如，与由天然来源纯化的hGH或以某种方式制备使得一级序列与天然hGH(不含N末端甲硫氨酸)相同的重组hGH相比，保留N末端甲硫氨酸的人生长激素(Met-hGH)能够促进非所需抗体的诱导。治疗性应用一般非常需要生产模拟天然蛋白质结构的重组蛋白质的低成本方法(Sandman等人，生物技术(Bio/Technology)13504-506，1995)。用于在细菌中制备天然蛋白质的一种方法是作为较大融合蛋白质的一部分表达所需蛋白质，该融合蛋白质在天然氨基酸序列起点的上游包含内切蛋白酶特异性切割的识别位点。这些识别和切割位点可以是能特异性切断靶向投递至膜或由细胞分泌的蛋白质的N末端信号肽的天然信号肽酶的识别位点。在其它情况中，可以将识别和切割位点导入融合蛋白质编码基因，使得重组蛋白质易于在体外或体内受到其它非天然内切蛋白酶的作用。例如，血液凝结因子Xa、胶原酶、和肠激酶可以用于由多种蛋白质释放不同的融合标签。然而，出于经济的考虑，在大剂量的制药学用途中一般排除内切蛋白酶的使用。用于在细菌中制备天然蛋白质的另一种方法是使用甲硫氨酸氨肽酶(MAP)来处理由大肠杆菌衍生的重组蛋白质的N末端甲硫氨酸。例如，可以用MAP处理Met-hGH而产生hGH。美国专利4,870,017和5,013,662描述了大肠杆菌甲硫氨酸氨肽酶的克隆、表达、和由多种肽和Met-IL-2除去Met的用途。分析了由多种肽底物释放氨基酸的能力，揭示MAP只切割长度为至少3个氨基酸的肽的N末端甲硫氨酸。第2位和第3位氨基酸的性质也显得很重要。例如，由Met-Ala-Met、Met-Gly-Met、Met-Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-Leu(SEQ ID NO1)、和Met-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Gln-Cys(SEQ ID NO2)可以释放甲硫氨酸，但是由Met-Phe-Gly、Met-Leu-Phe、Met-Met-Met等不释放甲硫氨酸。由Leu-Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-Leu(SEQ ID NO3)、Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Thr-Gln-Leu(SEQ ID NO4)、或Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Lys-Lys-Gln-Cys(SEQ ID NO5)不释放氨基酸。WO84/02351描述了使用亮氨酸氨肽酶由融合蛋白质制备成熟(天然)蛋白质(诸如人生长激素或人胰岛素原)的方法。通过氨肽酶的逐步切割可以转变具有氨基酸序列(Ym...Y2Y1)-(Pro)p-(X1X2...Xn)的融合蛋白质(其中(Ym...Y2Y1)-(Pro)p是前序列，余下的是成熟蛋白质，m是大于2的整数，Y是任意氨基酸，若X1或X2是Pro则p是0，若X1或X2不是Pro则p是1，X是任意氨基酸，n是大于或等于4的整数)，若p＝1或X1＝Pro则除去氨基酸Ym...Y2，若X2＝Pro则除去基团Ym...Y2Y1，然后，若p＝1则以已知的方式用酶一步或两步切除两个氨基酸Y1-Pro，若X1＝Pro则只类似的切除Y1。欧洲专利申请EP0204527A1公开了由通式为H-Met-X-Pro-Y-OH的蛋白质除去N末端甲硫氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
由重组蛋白质除去Ｎ末端丙氨酰基的方法，包括使所述重组蛋白质接触气单胞菌氨肽酶从而除去Ｎ末端丙氨酰基，并回收产生的重组蛋白质。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：JS陶，DW泰勒，
申请(专利权)人：法玛西雅公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]