雪旺细胞源神经营养因子及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种雪旺细胞源神经营养因子及其制备方法。它为一种酸性蛋白质，分子量为５０～５８ＫＤ，等电点为４．５５。本发明专利技术对脊髓运动神经细胞有很好的营养、存活作用和保护免受毒害、损伤的影响，对周围神经的再生有促进作用。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种。全世界每年有大量的周围神经损伤患者，占外伤病人总数的6％。尽管今天显微外科技术已使神细修复达到了极高的精确度，又细胞外科技术等，但疗效仍不满意，优级的效果只有50％，说明有必要从神经生长的内在机制寻找解决途径。50年代，Levi-Montalcini和Cohen发现了神经营养因子(NGF)，开创了神经研究的新领域。至今已经半个世纪，但中枢神经损伤后仍不能再生。1979年Lundborg发生再生室的研究方法后，在研究周围神经再生方面才有突破，周围神经损伤后，可以再生。形态学研究表明周围神经是神经细胞的伸延部分。周围神经损伤后，会发生变性，神经的远侧断端的轴突和髓鞘均崩溃和吸收，唯有雪旺细胞反而大量增殖，有独特的分泌功能及形成独特的膜管结构(Aguayo，AJ1981)，“迎接”新生的轴突，并给予营养，促进其再生。这表明了雪旺细胞在神经损伤后修复中的主导地位和作用。本专利技术的目的在于提供一种，其对脊髓运动神经细胞有很好的营养、存活作用和保护免受毒害、损伤的影响，对周围神经的再生有促进作用。本专利技术之雪旺细胞源神经营养因子为一种酸性蛋白质，分子量为50～58KD，等电点为4.55。其制备方法为(1)雪旺细胞的分离、培养和收集把大鼠体内预损伤的周围神经或新生大鼠的周围神经取出，去掉其外膜，剪碎，用酶溶法处理后，进行细胞培养，用差速粘附法把成纤维细胞分离出来，纯化雪旺细胞，用无血清培养，以排除来自血清的细胞因子的影响，最后培养出纯度达95％的雪旺细胞；(2)提取雪旺细胞源神经营养因子把雪旺细胞的无血清培养液或用超声捣碎细胞的上清液进行超滤收缩、收集＞10Kda分子，然后用SephadexG-100凝胶层析作初步分析，分段收集几个组分，把对脊髓前角运动神经元生物活性最好的一个组分、再上高效液相色谱(HLPC)分析，最后收集到一个对脊髓前角运动神经元生物活性最好的一组分。本专利技术具有如下优点1、从雪旺细胞提取一种新的神经营养蛋白，其分子量为50KD-58KD，不同于目前国外已经从其它组织中提纯的神经营养因子。体内实验证实，该蛋白具对胚龄12～14天大鼠的脊髓前角运动神经元有维持存活的营养作用。体内实验证实能促进损伤后的周围经再生，并发生其生物活性强度与剂量之间存在量效依赖关系。其活性作用不能被神经生长因子抗体阻断。2、体外试验证明这种雪旺细胞源神经营养因子不仅对脊髓前角运动神经细胞有营养作用，还可以对抗NO的神经细胞的毒性影响，起保护神经细胞作用。3、体内试验证明这种雪旺细胞源神经营养因子可保护脊髓前角运动神经细胞，不被其周围神经损伤所引起调亡和促进周围神经的再生。4、本专利技术用超声粉碎法使雪旺氏细胞粉碎以提取蛋白，由于此思路上的突破和方法学上的创新，极大地提高了蛋白提取量，同时使神经营养蛋白分离的精确度增高，过程简化，节省时间。下面结合附图和实施例对本专利技术作详细描述。附图说明图1为标接记反应混合物的柱层析淋洗曲线图。图2为标记物免疫活性鉴定曲线图。图3为温度、时间对配体结合的影响图。图4为结合饱和曲线图。图5为Scatchard分析图。图6为125I-SDNF特异结合动力学分析图。雪旺细胞源神经营养因子(Schwann’s cell Derived Neurotrophic Factor简称SDNF)是从雪旺细胞(Schwann’s cells简称SC)直接分泌出的细胞因子，对脊髓前角运动神经细胞有很强的营养作用和对周围神经再生有很强的促进作用。其详细技术资料，可分下列十四个部分说明一.雪旺细胞的分离与纯化(一)主要试剂与仪器1.胰蛋白酶Sigma USA2.胶原酶(IV) Sigma USA3.雪旺细胞培养液pH7.3DMEM/F12培养基 Sigma 80ml胎牛血清 杭州四季青生物工程公司 20ml青霉素100u/ml链霉素100u/ml碳酸氢钠Sigma 1.2mg/ml4.塑料培养瓶(50cm2) Sigma USA5.5％二氧化碳培养箱 Heraeus Germany6.200目不锈钢网 Sigma USA7.超净工作台 苏州安泰净化设备厂(二)方法1.取材取200只SD大鼠，体重200～250克/只，每次20只，10％水合氯醛腹腔麻醉(0.3ml/100g)，无菌条件下在梨状肌下缘切断单侧坐骨神经，缝合伤口。术后14天，无菌条件下切取损伤侧瓦勒变性的坐骨神经，置入D-Hank液中漂洗三次，解剖镜下剥去神经外膜，再用D-Hank液中漂洗二次。2.雪旺细胞的分离在解剖镜下将神经剪成约1～2mm3长碎块后移入50ml培养皿中，加入经37℃复温的0.25％胰蛋白酶+1000u/ml胶原酶各2～3ml，37℃下消化30分钟(20、25分钟时各振摇一次)然后加入等量的含20％胎牛血清的雪旺细胞培养液，终止消化。吹打后过200目不锈钢网。滤液以2500r/min离心3分钟，弃上清，加培养液重悬沉淀的细胞。3.雪旺细胞的纯化将上述雪旺细胞悬液含20％胎牛血清的雪旺细胞培养液稀释调整细胞浓度至1×107～2×107cells/ml，接种于50cm2塑料培养瓶中(5ml/bottle)，在37℃、5％CO2培养箱内培养30分钟(15分钟时轻摇一次)翻转180度，继续培养30分钟(15分钟时轻摇一次)，吸出瓶中的细胞悬液，免疫组化鉴定雪旺细胞纯净度。二.雪旺细胞的免疫组化鉴定(一)主要试剂1.兔抗鼠S-100蛋白 Sigma USA2.生物素-羊抗兔IgG和LSAB复合物 Dako公司试剂盒3.DAB显色剂Sigma USA(二)方法1.取经双30分钟差速粘附后的雪旺细胞悬液1ml接种于塑料培养皿中，皿底放一块薄盖玻片，加20％胎牛血清的雪旺细胞培养液5ml，置37℃、5％CO2细胞培养箱培养6天每隔2～3天换一次培养液并在倒置镜下观察细胞的的生长和形态。2.将载有雪旺细胞的盖玻片取出，PBS漂洗除去血清蛋白，丙酮固定5分钟，按LSAB法，免疫组化鉴定雪旺细胞3％H2O2处理5分钟，PBS洗3次，每次15分钟，10％山羊血清封闭15分钟，加兔抗鼠S-100蛋白(1∶80)，37℃孵育30分钟，PBS洗15分钟，生物素-羊抗兔IgG(1∶200)，37℃30分钟，PBS洗15分钟，显微镜下进行DAB/H2O2(0.05％/0.01％)显色，流水冲洗5分钟，苏木素-伊红复染，梯度酒精脱水，封片。阴性对照组用PBS代替S-100蛋白。(三)结果1.倒置镜下观察培养6天的雪旺细胞大量繁殖，密集成片，细胞大部分呈双极突起，少数为多突起(图1)。2.雪旺细胞免疫组化鉴定经双30分钟差速粘附后的雪旺细胞悬液培养6天时，对抗S-100蛋白呈阳性反应，细胞纯净度达90％。三.用无血清培养液培养雪旺细胞(一)材料与方法1.主要试剂SC-SFM(SC无血清培养液)PH7.3DME/F12混合培养液100ml，添加碳酸氢钠1.2mg/ml 胰岛素(Sigma I 1882)10ug/ml人转铁蛋白(Sigma T 1147)5ug/ml孕酮(Sigma P 6149)20ng/ml腐胺(Sigma P6024)16ug/ml 硒酸钠(Sigma S 9133)20ng/ml2.实验方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种雪旺细胞源神经营养因子，其特征在于它为一种酸性蛋白质，分子量为５０～５８ＫＤ，等电点为４．５５。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱家恺，
申请(专利权)人：中山医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]