用于表达两种外源基因的载体制造技术

本发明专利技术提供了一种用ＲＲＥ序列表达两种外源基因并通过修饰来控制这些基因的表达量之比的载体。可作为基于ＳＩＶａｇｍ的慢病毒载体提供的这种载体，通过将病毒来源的表达调控序列修饰成另一表达调控序列以消除对病毒来源的蛋白的依赖而构建。尽管这种载体含有包装信号，但是它已通过修饰降低了因基因重组可能出现野生型病毒株的风险并且不再表达病毒结构蛋白。这种载体作为需要转移两种基因同时又要控制它们的表达量或表达量之比的基因治疗载体是非常有用的。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及表达外源基因的载体。
技术介绍
传递基因的载体可用于研究和基因治疗以便在靶细胞中表达外源基因。在所述情况下，有时需要在同一靶细胞中表达两种基因。这将允许插入了治疗基因的靶细胞通过联合表达选择性基因与治疗基因而选择性地增生或死亡。另一方面，这将允许通过联合表达治疗基因与标记基因(如GFP等)而监控治疗性转基因细胞的体内动力学。而且，这将允许那些通过在两类亚基之间形成复合物而起作用的蛋白，如受体和转录因子表达。过去已报道过插有多个启动子的形式和一个启动子与IRES(内部核糖体进入位点)序列结合的另一种形式作为共表达两种基因的载体系统。但是，这些载体的表达性能却不能令人满意。例如，由于启动子之间的干扰，含有多个启动子的载体仅从其中一个启动子表达时出现表达效力的问题。另一方面，含有一个启动子与IRSE序列组合的载体存在的问题是从IRES的3’端表达基因时，其表达水平仅仅是从IRES 5’端表达的1/5到1/10。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可以共表达两种外源基因的载体。更具体地说，本专利技术的目的是提供一种可以用RRE序列共表达两种外源基因并且可以通过修饰RRE序列来调节两种外源基因表达水平比例的载体。在优选的实施方案中，提供了一种病毒载体，其中可以将源自病毒的表达调控序列改变成另一种表达调控序列，这样就消除了对源自病毒的蛋白的依赖。在另外一个优选实施方案中，提供了一种含有包装信号的病毒载体，其中可以改变该载体，从而降低因基因重组产生野生型病毒株的风险并使该载体不再表达病毒结构蛋白。本专利技术者使用RRE和有各种优点的猴免疫缺陷病毒(SIV)产生了一种新的病毒载体，其中所述优点如与基因治疗领域中常用的人类免疫缺陷病毒(HIV)相比更好的安全性。具体地说，首次将依次含有5’LTR区、RRE、CMV启动子、EGFP基因(或β-半乳糖苷酶基因)和3’LTR的载体构建为基于SIVagmTY01的基因转移载体，其中的SIVagmTY01是非致病性非洲绿猴免疫缺陷病毒的一个克隆。由于将基因转移载体包装到载体颗粒中需要包装细胞中对基因转移载体反式作用的病毒结构蛋白，本专利技术人为了在包装细胞中提供病毒结构蛋白还构建了一种包装载体。也就是说，构建了在包装细胞中表达病毒外壳蛋白(VSV-G)的载体和表达病毒核心蛋白(gag)和逆转录酶(pol)的载体。慢病毒5’LTR的转录活性一般取决于Tat蛋白，这种蛋白是一种源自病毒的因子。所以，本专利技术人随后又产生了一种基因转移载体，在该载体中用另外一个启动子序列取代U3区，即5’LTR的启动子序列，从而消除了所产生的基因转移载体对Tat蛋白的依赖性并且通过用具有较强转录活性的启动子序列进行取代来增加载体滴度，这样就提供了不依赖Tat的载体。已发现在慢病毒载体中，因为在靶细胞中逆转录时将3’LTR区中所含的启动子序列U3区插入到5’LTR的U3启动子区，在基因转移载体质粒的3’LTR区所含的U3区发挥5’LTR的U3启动子的功能，它与靶细胞基因组中的基因表达有关。所以，产生一种用另一启动子序列取代基因转移载体中3’LTR的U3区的载体来测定是否能够用不含有U3序列的启动子取代靶细胞内与基因表达相关的启动子。此外，为测定是否能够同时缺失靶细胞内5’LTR中的启动子序列，产生了一种基因转移载体，其中3’LTR的U3区已缺失。将基因转移载体包装到载体颗粒中需要包装信号，一种对基因转移载体起顺式作用的因子，此外，通过增强载体的包装效率将会提高载体滴度。所以，应当插入尽可能长的含有包装信号的区域，以便保持包装信号序列所形成的结构。然而，另一方面，使基因转移载体的包装信号和包装载体之间的序列重叠最小化就将由于两种序列间可能出现的重组引起的野生型病毒的产生频率抑制到最小。所以，为了构建载体系统，必需正确鉴定有效包装基因转移载体所需的最小包装信号序列。这样，本专利技术人将含有不同长度的5’LTR下游区域的DNA片段插入了基因转移载体来提供安全而有包装能力的载体。接着，本专利技术人产生了一种允许同时表达两种外源基因的病毒载体。Rev应答元件(RRE)是源自病毒的Rev蛋白结合位点，它与RNA从核到胞质的运输有关。使用这种RRE/Rev系统，可以检测出通过剪接效率的调节是否可产生可以从单一启动子共表达两种不同类型的蛋白的系统。首先，为了检测RRE是否能够调节两种不同类型蛋白的表达，产生了一种载体，其中分别在RRE的上游和下游插入萤光素酶基因和β-半乳糖苷酶基因作为报道基因，在萤光素酶基因的上游插入剪接供体序列并且在RRE序列的下游插入剪接受体序列。预计在这种载体中剪接过的mRNA会表达β-半乳糖苷酶蛋白并且没有被剪接的mRNA会表达萤光素酶蛋白。而且，为了不仅能够检测两种不同基因的表达，而且也能够检测通过改变RRE的序列而对这两种基因的表达量之比的调节，产生6种插有RRE序列的载体来测定在每种这类载体中报道基因的表达水平。结果发现含有RRE序列的载体能够表达两种不同类型的基因，并且通过RRE序列的取代能够调节两种基因的表达效率。此外，因为没有包装载体时可以表达两种不同类型的基因，故发现该基因表达系统可以不依赖于Rev蛋白的存在而表达两种类型的基因。过去人们认为RRE的作用依赖于Rev蛋白，并且Rev/RRE的调节是“全或无”的情况。因此，在Rev-的情况中均是剪接形式，而在Rev+的情况中为非剪接形式。也就是说，从来没有改变RRE序列造成剪接比例改变的例子。所以，上述结果首次证实了改变RRE序列能够改变剪接的比例。本专利技术人还检测了利用RRE共表达两种基因的系统是否能应用于使用各种非5’LTR启动子的表达系统。使用了源自人巨细胞病毒(CMV)的其他启动子和源自哺乳动物细胞的启动子(EF1α启动子)。结果发现即使当使用非5’LTR启动子时，也能够同时表达两种类型的基因。此外，发现两种类型基因的表达水平的调节依赖于RRE序列。所以，发现在利用了各种启动子的表达系统中，使用RRE共表达两种基因的系统有广泛的用途。另外，还根据报道基因插入RRE上游或下游的不同情况检测了每种基因的不同表达水平。产生了在基因转移载体中萤光素酶和β-半乳糖苷酶位置互换的两种载体以比较这两种载体中两种报道基因的表达水平。结果发现不论将它们插入RRE的上游或下游，在报道基因的表达水平上都没有差异。如上所述，本专利技术人成功地产生了一种新型病毒载体，这种载体能够用RRE序列共表达两种基因并且因所用的RRE序列中的差异能够调节两种基因的表达比例，由此完成了本专利技术。更具体地说，本专利技术涉及(1)一种能表达两种外源基因的载体DNA，该载体DNA从5’端到3’端依次含有下列部分(a)表达调控序列；(b)剪接供体序列；(c)第一种外源基因的插入位点；(d)RRE核心序列；(e)剪接受体序列；和(f)第二种外源基因插入位点；(2)一种能表达两种外源基因的载体DNA，该载体DNA从5’端到3’端依次含有下列部分(a)表达调控序列；(b)剪接供体序列；(c)RRE核心序列；(d)第一种外源基因的插入位点；(e)剪接受体序列；和(f)第二种外源基因插入位点；(3)按照(1)或(2)所述的载体DNA，其中RRE核心序列源自逆转录病毒；(4)按照(1)或(2)所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于表达两种外源基因的载体ＤＮＡ，该载体ＤＮＡ从５’端到３’端依次含有下列部分：（ａ） 表达调控序列；（ｂ） 剪接供体序列；（ｃ） 第一种外源基因插入位点；（ｄ） ＲＲＥ核心序列；（ｅ） 剪接受体序列；和（ｆ） 第二种外源基因插入位点。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：中岛俊洋，中丸健治，长谷川护，速水正宪，井户荣治，
申请(专利权)人：株式会社载体研究所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]