抗病毒活性的人α干扰素衍生物制造技术

本发明专利技术涉及一种由１７１个氨基酸组成的具有超强抗病毒比活性的人α干扰索衍生物（ＩＦＮ－ＳＡ）及其重组制备。ＩＦＮ－ＳＡ比天然人α干扰索的抗病毒比活性强５０－１００倍，达到５－１０×１０↑［９］ＩＵ／ｍｇ，可望成为治疗病毒性疾病的新一代干扰素产品。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新型的具有超强抗病毒比活性的人α干扰素衍生物(IFN-SA)及其制备方法和用途，其特征在于它具有的抗病毒比活性高达5-10×109IU/mg，具有治疗和预防病毒感染性疾病方面的巨大潜力。干扰素是一类由单键分子组成的相对小分子量的蛋白多肽，它由体内多种细胞在受到病毒感染和抗原刺激后产生。干扰素具有抗病毒、抗增殖和免疫调节的功能，因此具有巨大的临床应用价值，如治疗病毒性疾病和肿瘤、多发性硬皮病等。虽然干扰素发现已有数十年，但其蛋白质和基因结构等研究是近二十年的工作，有许多问题尚待深入。人干扰素分为三大类即α、β和γ型，分别由白细胞、成纤维细胞和淋巴细胞产生而命名。人α干扰素由166个氨基酸组成，分子量在19000道尔顿左右，虽然证明含有糖基，但与其抗原性和生物活性无关。目前已经克隆并确定出氨基酸序列的人α型干扰素亚成员有约20种，可能还会有新的亚型出现。如果将经突变或改造的人α干扰素衍生物加上，要经基因工程手段生产出相当数量的各种人α干扰素衍生物或类似物。其中最引人注目的是复合型α干扰素(concensus interferon)。复合型α干扰素是一种新型干扰素，它是根据已知的人α干扰素亚型的氨基酸序列中氨基酸同源性高的原则组合而成，再经人工合成其相对应的基因，经大肠肝菌表达纯化而得。重组复合型干扰素的抗病毒比活性是目前发现的任何一种天然α型干扰素的10倍，达到比活性1.0×109单位以上。重组复合型α干扰素(商品名Infergen)已批准用于治疗慢性丙型病毒性肝炎，疗效显著。重组复合型α干扰素由美国Amgcn公司专利技术，它仍曲166个氨基酸组成，但有三种形式即甲硫氨酰型(methionyl)、去甲硫氨酰型(des-methionyl)和N-乙酰化甲硫氨酰型(N-acytaled methionyl)，即具有结构不均一性的缺陷。重组天然的α型干扰素如IFN-α2a、1b和2b，同样由166个氨基酸组成，它们是一种重要的抗病毒和抗肿瘤的治疗药物。但现有的α干扰素制剂的临床治疗效果尚不理想其抗病毒比活性仅为1.0×108IU/mg左右，存在着大剂量时副作用较大的缺点。本专利技术所述的超强抗病毒活性α干扰素衍生物由171个氨基酸组成，具有的抗病毒比活性达到5-10×109IU/mg，比复合型α干扰素强5-10倍，比天然α干扰素强50-100倍。超强抗病毒活性α干扰素衍生物IFN-SA其氨基酸序列特征在于其N-末端比天然α干扰素多出5个氨基酸是Gly Ser Gly Gly Gly，从第6位到171位氨基酸序列以14种人α干扰素的氨基序列为基础，采用同源性组合原则设计而成。人α干扰素和复合型α干扰素均含有二对二硫键，即Cys1和Cys29及Cys99和Cys139组成。本专利技术中超强抗病毒活性α干扰素衍生物的二对二硫键位于Cys7与cys34，Cys104与Cys144之间，由于二硫键不处于其N末端第一氨基酸位置，十分有利于二硫键的形成和稳定。目前重组α干扰素和复合型α干扰素的制备多采用变性和复性的方案，加再加上在N末端会出现甲硫氨酰或修饰的甲硫氨酰，推测对第一对二硫键(Cys1和Cys29)的构象形成十分不利。本专利技术所述的重组超强抗病毒活性α干扰素衍生物IFN-SA采用分泌型融合表达的方式，加上第一对二硫键位于Cys7和Cys34之间，因此有效地避免了变性和复性的过程，保证了二硫键的最佳构象形成，其N末端不含有甲硫氨酰，终产物是单一的由171个氨基酸的重组IFN-SA。本专利技术提供的重组超强抗病毒活性α干扰素衍生物IFN-SA具有抗病毒作用更强，副作用更小，病毒消除更有效，更适合于病毒性感染疾病如病毒性肝炎、单纯疱疹病毒感染和病毒性流感、EB病毒感染等的治疗和预防。本专利技术中超强抗病毒活性α干扰素衍生物IFN-SA的蛋白质氨基酸序列如下g s g g g c d l p q t h s l g n r r a l i l l a q m r r i s p f s c l k d r hd f g f p q e e f d g n q f q k a q a i s v l h e m i q q t f n l f s t k d ss a a w d e s l l e k f y t e l y q q l n d l e a c v i q e v g v e e t p lm n v d s i l a v r k y f q r i t l y l t e k k y s p c a w e v v r a e i m rs f s l s t n l q e r l r r k d以上蛋白质氨基酸相对应的基因序列用人工合成而得(详见实例)，所述表达载体的宿主细胞包括细菌、酵母和哺乳动物细胞。重组超强抗病毒活性α干扰素衍生物IFN-SA的制备方法包括相对应的基因人工构建，含其DNA序列的重组表达载体的筛选，宿主细胞的转化，发酵和纯化等步骤。由上述制备方法制取的重组超强抗病毒活性α干扰素衍生物IFN-SA具有5-10×109IU/mg的抗病毒比活性，通过相应的制剂技术制备成注射用水针或冻干粉针、外用型的膏剂或乳剂以及口服型的含化片或胶囊、片剂等。下面通过本专利技术的实例，对本专利技术作更详细的描述。实例1超强抗病毒活性α干扰素衍生物IFN-SA的基因人工构建根据本专利技术的超强抗病毒活性α干扰素衍生物IFN-SA蛋白质的氨基酸序列选择大肠杆菌偏爱密码子，消除不利于表达的二级结构设计和密码子的简异性，设计出如下优选的DNA序例(513bp)GGATCCGGTGGTGGTTGTGACCTGCCGCAGACTCATTCCCTGGGTAACCGTCGCGCTCTGATCCTGCTGGCACAAATGCGTCGTATCAGCCCGTTTTCTTGTCTGAAGGATCGTCACGACTTTGGCTTTCCGCAAGAAGAGTTCGATGGCAACCAGTTCCAGAAAGCACAGGCTATCAGCGTACTGCATGAAATGATCCAGCAAACCTTCAACCTGTTCTCCACTAAAGATAGCTCTGCTGCATGGGACGAAAGCCTGCTGGAGAAATTCTACACCGAACTGTATCAGCAGCTGAACGATCTGGAAGCATGCGTAATTCAGGAAGTAGGTGTAGAAGAGACTCCGCTGATGAACGTCGATTCTATCCTGGCAGTTAGAAAGTACTTCCAGCGTATCACCCTGTACCTGACTGAAAAAAAGTACTCTCCGTGCGCTTGGGAAGTAGTTCGTGCTGAAATCATGCGTTCCTTCTCTCTGTCTACTAACCTGCAAGAGCGTCTGCGTCGTAAGGAC根据上述设计的DNA序列，分别合成8个DNA片段，相互依次重叠20碱基，其退火湿度为62℃。再合成两个33bp的上游引物和下游引物，分别与5`端和3`端配对，分别含有BamHI和HindIII两个限制性的酶切位点。应用PCR反应体系扩增出530bp大小的DNA片段，经回收纯化后由BamHI和HindIII双酶切，构建PUC18载体的BamHI和H本文档来自技高网...

【技术保护点】
本专利技术中所述超强抗病毒活性人α干扰素衍生物（ＩＦＮ－ＳＡ）由１７１个氨基酸组成，具有以下的氨基酸序列： ｇｓｇｇｇｃｄｌｐｑｔｈｓｌｇｎｒｒａｌｉｌｌａｑｍｒｒｉｓｐｆｓｃｌｋｄｒｈ ｄｆｇｆｐｑｅｅｆｄｇｎｑｆｑｋａｑａｉｓｖｌｈｅｍｉｑｑｔｆｎｌｆｓｔｋｄｓ ｓａａｗｄｅｓｌｌｅｋｆｙｔｅｌｙｑｑｌｎｄｌｅａｃｖｉｑｅｖｇｖｅｅｔｐｌ ｍｎｖｄｓｉｌａｖｒｋｙｆｑｒｉｔｌｙｌｔｅｋｋｙｓｐｃａｗｅｖｖｒａｅｉｍｒ ｓｆｓｌｓｔｎｌｑｅｒｌｒｒｋｄ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：范开，马素永，张益，王建，刘凡，聂李亚，
申请(专利权)人：重庆富进生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]