编码细胞壁降解酶的核酸序列和在设计对镰孢和其他病原体的抗性中的应用制造技术

本发明专利技术涉及来源于镰孢真菌基因的、编码细胞壁降解酶葡聚糖酶、内切壳多糖酶和外切壳多糖酶的核酸序列；具有葡聚糖酶、内切壳多糖酶和外切壳多糖酶活性的分离的多肽；包含该核酸序列的重组核酸分子、载体和宿主细胞，以及生产和使用该多肽的方法，包括在植物细胞中表达以赋予或提高某种植物对镰孢和其他病原体的抗性。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
1.专利
本专利技术涉及来源于真菌基因的、编码具有细胞壁降解活性的多肽的核酸序列，以及分离的具有细胞壁降解活性的多肽。本专利技术也涉及含有该核酸序列的重组核酸分子、载体和宿主细胞，以及生产和使用该多肽的方法，包括在植物细胞中表达以赋予或提高植物对镰孢(Fusarium)和其他病原体的抗性。2.本领域的描述综述对本国市场和出口市场来说，小麦都是最重要的粮食作物之一。美国每年大约生产24亿蒲式耳小麦，价值超过70亿美元。镰孢性穗枯萎(Fusarium head blight)或疮痂病(scab)是小麦、大麦、燕麦、黑麦和冰草的一个真菌性疾病，它影响谷粒的产量和质量。它在世界各处都可发生，特别是在抽穗期，当温度和湿度适合致病因子——禾谷镰孢(Fusarium graminearum)增殖的时候。在近十年内，穗枯萎病使美国和加拿大的种植者和加工者遭受了数十亿美元的损失。在明尼苏达州、北达科他州和南达科他州，由于镰孢性穗枯萎病所造成的小麦产量和谷物质量方面的损失在1993年接近10亿美元，其后几年又损失了2-4亿美元。在俄亥俄州、密西根州、印地安那州和伊利诺斯州，该病所造成损失在1995和1996年超过3亿美元。谷物的质量也大打折扣，因为受感染的谷物通常会被真菌产生的、对人和牲畜有害的真菌毒素、呕吐毒素或脱氧瓜蒌镰菌醇(DON)所污染。除此之外，该病害在上述中西部地区威胁大麦的生产，因为啤酒生产者根本不能容忍在谷物中存在呕吐毒素。穗枯萎病谷类作物，包括小麦、玉米、大麦、燕麦和黑麦，对许多类型的真菌和多种致病性镰孢属真菌是易感的。禾谷镰孢(Schwabe)和大刀镰孢(Fusarium culmorum)是小麦、大麦、燕麦和黑麦的被称作镰孢性穗枯萎病、穗枯萎病或疮痂病的主要致病因素(见Bai和Shaner 1994；Parry等1995的综述)。病原体的生命周期在两个宿主——小麦和玉米之间交替。禾谷镰孢的冬孢子体(teliomorph)(有性阶段)被称作玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)，可引起玉米的茎、穗腐烂和幼苗的穗枯萎。穗枯萎病是小麦和大麦的一个世界性问题，而且自1991以后在美国以流行比例发病。至今，在小麦、大麦或它们的有性兼容性亲缘植物中还没有鉴别出镰孢性穗枯萎病的有效的抗性基因。由于缺乏对该病害的抗性，加上免耕农业和不利的气候模式，结果造成12个州的小麦和大麦工业遭受了26亿美元的直接损失。由免耕农业导致的玉米和小麦留茬的不断积累有助于孢子和分生孢子在田间的增殖。而且，开花(花粉脱落)时降雨期和温暖的温度都有利于病原体的发芽和生长。禾谷镰孢引起含发育中的谷粒的花器官(小花)的死亡，使穗呈现漂白状或“痂状” 外观，并造成谷物从中等程度到严重程度的减产。除此之外，禾谷镰孢和其他种类的镰孢可产生单端孢菌素真菌毒素，例如脱氧瓜蒌镰菌醇(DON)，它会使疾病恶化，并对摄取了被污染的谷类产品的人和牲畜造成健康威胁。早在1891年，小麦穗对镰孢的显著易感性就被Arthur注意到了(Parry等，1995)。Puge及其合作者(1933)报告说用培养的玫瑰色镰孢(F.roseum)(大刀镰孢)分生孢子接种过的小麦穗在从开花到蜡熟初期的20天期间是最易感的，这取决于品种。裂开的花药和其他正在退化的组织似乎成为供菌丝增殖蔓延进韧皮部并遍及穗的其他部分的疫源地。在组织学研究中，Puge注意到菌丝通常在细胞间侵入，但是能穿透小花的内部薄壁。虽然禾谷镰孢能在花的不同部分上移植生长，但在实验室和田间研究都证明感染的迅速传播与突出的花药的存在有关(Andersen 1948，McKay和Loughnane，1945)。花药的水样提取物被发现可以在体外刺激菌丝的生长(Strange和Smith 1971)，然而大分生孢子的萌发似乎不受影响(Strange和Smith，1978)。菌丝的生长刺激作用几乎可以完全归功于两个季铵化合物甜菜碱和它的前体胆碱(Strange等，1974)。这些化合物存在于小花的其他器官，但是在花粉中最为丰富(Pearce等，1976)。甜菜碱——一种渗透性杀虫剂，在干燥期间累积，越过了花粉发育的整个正常过程(见McCue和Hanson的综述，1990)。它同胆碱一起被假定为禾谷镰孢和其他的真菌病原体的碳和氮的一个偶然的来源。现在还不清楚是否真菌菌丝可以很容易地接近花粉表面的这些化合物，或者一定要侵入花粉细胞质才能接近它们。如果要在明尼苏达州，北达科他州和其他州继续生产小麦和大麦，那么就必须鉴定出抗镰孢性穗枯萎病的基因。那怕只把镰孢感染降低10％，那么给粮食的生产者、加工者、以及最终给消费者节约下来的经济效益预计可达到数百万美元。研究人员已经在小麦和其他的谷类作物的种质中鉴别出抗疮痂病的多基因座，但是目前，通过传统育种方式在合适的作物品种中获得的对病害的耐受程度是不足以控制病原体的。既然免耕农业对水土保持有明显的好处，而镰孢在小麦产区又如此广泛地存在，故而宿主抗性需要可替代的来源。对这种病害没有有效的控制措施。镰孢性穗枯萎病的抗性基因还没有从小麦、大麦或其他的有性兼容性植物品种中鉴别出来，这就限制了小麦育种专家发展抗性作物品种的努力。人们所需要是获得抗镰孢性穗枯萎病的作物品种的方法。真菌的葡聚糖酶和壳多糖酶的作用在包括镰孢在内的许多真菌中，葡聚糖和壳多糖是细胞壁的基本成分。镰孢的外壁层是由β-1，3和β-1，6键连接的葡萄糖的聚合物(1，3/1，6-β-D-葡聚糖)组成的。最内基底层主要是由壳多糖微丝——β-1，4-N-乙酰氨基葡萄糖的线性聚合物组成的，它占了菌丝壁质量的三分之一(Barbosa和Kemmelmeier 1993)。镰孢细胞壁似乎更能抵御水解酶的活性，这可能是因为蛋白质和壳多糖的含量很高(Sivan和Chet，1989a)，以及乙酰化氨基葡萄糖残基的聚集(Fukamizo等，1992)。壳多糖酶和葡聚糖酶是由自然存在的细菌、真菌和植物制造出来的。在真菌中，这些蛋白质分别在细胞壁的壳多糖和葡聚糖的自身水解中，以及其他微生物的细胞壁成分的水解中起作用(Srivastava等，1985；Sivan和Chet，1989b；Chérif和Benhamou，1990；V zquez-Garcidue as等，1998)。后者的特征被应用到发现抗微生物的生物防治剂方面。壳多糖也在昆虫的角皮和线虫类的卵壳中被发现。对于能利用壳多糖作为碳源的真菌，壳多糖酶可能在真菌的新陈代谢中起作用(Flach等，1992)。内切壳多糖酶在壳多糖聚合物里面随机裂解C1和C4之间的化学键(Flach等，1992；Graham和Sticklen，1994)，而外切壳多糖酶连续地裂解每个化学键，从壳多糖聚合物的末端释放出壳二糖。N-乙酰氨基葡萄糖糖苷酶也在末端裂解，释放N-乙酰葡糖胺(Flach等，1992)。同样，内切葡聚糖酶随机地在葡聚糖聚合物里面裂解β-键，产生短寡糖，而外切葡聚糖酶从聚合物的非还原端裂解单个葡萄糖残基(Vazquez-Garciduenas等1998)。真菌细胞壁葡聚糖层的水解应归功于内外切葡聚糖酶的联合作用。作为抗真菌蛋白质的葡聚糖酶和壳多糖酶。真菌细胞壁与众不同的葡聚糖和壳多糖组本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码具有葡聚糖酶活性的多肽的分离的核酸分子，其选自：（ａ）与下列序列有至少７０％核苷酸序列同一性的核酸序列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的第３７位到９４２位核苷酸；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３的第１８０１位到２７６１位核苷酸；或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６的第１８位到９２３位核苷酸；（ｂ）编码具有葡聚糖酶活性的多肽的核酸序列，所说的多肽具有与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２，４，５或１７的第１到３０１位氨基酸有至少８０％同一性的氨基酸序列；（ｃ）在中度或高度严格条件下能与下列序列杂交的核酸 序列：（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的第３７位到９４２位核苷酸；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３的第１８０１位到２７６１位核苷酸；或ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６的第１８位到９２３位核苷酸；（ｉｉ）（ｉ）的至少１００个连续核苷酸的子序列；或（ｉｉｉ）（ｉ）或（ｉｉ）的互补链；和（ｄ）（ａ）、（ｂ）或（ｃ）的子序列，其中该子序列编码有葡聚糖酶活性的多肽片段。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：PA奥库巴拉，AE布莱切，TM霍恩，RM博卡，
申请(专利权)人：由农业部部长代表的美利坚合众国，诺沃奇梅兹生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]