固相支持物表面双链核酸的制备方法技术

固相支持物表面双链核酸的制备方法是基础分子生物学及生物医学领域中在固相支持物制备双链核酸的一种独特方法，运用这种方法制备连接双链核酸的固相支持物。该制备方法包括如下步骤：（ａ）化学合成两种单链寡核苷酸片段，其中一个为通用单链寡核苷酸片段，另外一个为探针单链寡核苷酸片段，（ｂ）在液相反应体系中将该通用单链寡核苷酸片段与探针单链寡核苷酸复性并进行核酸连接酶连接反应，（ｃ）将单分子核酸样品点样到表面被醛基修饰的固相支持物表面，经胺化的脱氧胸腺嘧啶核苷酸将单分子核酸连接在固相支持物表面；（ｄ）寡核苷酸微阵列经核酸聚合酶延伸反应，填平固定的单分子核酸的单链寡核苷酸部分，在支持物表面合成完整的双链核酸分子。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是基础分子生物学及生物医学领域中在固相支持物制备双链核酸的一种独特方法，运用这种方法制备连接双链核酸的固相支持物。
技术介绍
在固相支持物上组装双链核酸的技术在制造双链核酸微阵列芯片、筛选核酸结合蛋白(如转录因子)及核酸结合药物等领域具有重要应用价值。特别是本专利技术对于制备双链核酸微阵列芯片，提供了一种经济、高效的技术体系。生物芯片主要是指在固相支持物上组装的核酸、蛋白质、细胞、微小组织等生物活性物质构成的微阵列。应用生物芯片可实现对待检样品中目标核酸分子、蛋白质分子、细胞、微小组织等物质的有无及多少进行准确、快速、大信息量检测。具有微型化、高通量和自动化的检测特征。生物芯片在生物检测、医学检测及疾病诊断、药物筛选和基因序列分析上有着极其重要的应用价值意义，因此受到广泛关注和投资，使其已经成为一个全球性的新型产业，即生物芯片产业。目前生物芯片的研究和开发种类逐渐趋于多样化，包括最初开发并广泛应用的基因芯片、暂露头角却气势逼人的蛋白质芯片、具有生命特色的细胞芯片和组织芯片。基因芯片和蛋白质芯片能够在转录和翻译两个层面上实现对基因表达的检测，在基因组和蛋白质组的研究中已经成为极其重要的技术平台，同时对医学临床诊断、新药筛选、疗效分析等生物医学领域产生了革命性的影响。从构成上来说，基因芯片和蛋白质芯片分别由单链DNA寡核苷酸分子和蛋白质分子构成，因此基因芯片只能依靠核酸分子之间的杂交检测经核酸扩增后的样品中目标单链DNA分子的有无及多少，蛋白质芯片主要通过蛋白质与样品中靶蛋白分子的识别及结合检测靶蛋白分子的有无及多少。因此基因芯片不能检测蛋白质，蛋白质芯片也难于检测DNA，这限制了运用DNA芯片直接对蛋白质的检测，而DNA与蛋白质的识别及相互作用在基因组稳定性维持及基因的表达调节中发挥极其重要的作用。传统分子生物学中用来研究DNA与蛋白质相互作用的常规方法主要是凝胶迁移实验(gel shift mobility assay)，但这种方法对实验样品数量需求大、实验耗时长、分析效率低，而且存在放射性标记对实验人员及环境的危害。双链核酸微阵列芯片是一种生物芯片。双链核酸微阵列芯片能够克服单链核酸微阵列不能检测蛋白质的缺陷，因为DNA结合蛋白常常识别和结合的是双链DNA，籍此在基因的表达调控中发挥重要作用。双链核酸微阵列芯片的制备是这种芯片应用的关键。Lockhart等最早在1996年就提出在固相介质上制备双链DNA探针分子的方法(US patent No.5,556,752)，其基本方法是将两段碱基互补的寡核苷酸运用连接分子连接在一起，将一段固定到固相介质上，通过退火使两段碱基互补的寡核苷酸复性，形成带有突环的双链核酸单分子，用于检测DNA结合生物分子；这一方法由于化学合成两段寡核苷酸，因此生产效率低，成本较高。Bulyk等在1999年最早提出双链核酸微阵列芯片概念，并运用核酸聚合酶引物延伸方法制备双链核酸微阵列(US.Pat.6,326,489)。其主要内容是首先在玻片上通过光刻掩膜原位合成单链寡核苷酸微阵列，合成的每条单链寡核苷酸靠近玻片的3′含有通用引物退火序列，单链寡核苷酸微阵列与通用引物退火后，进行聚合酶引物延伸反应，合成第二链核酸，从而形成双链核酸微阵列。这一方法的缺点是需要在固相介质表面合成含有引物结合位点的较长的寡核苷酸，不利于降低生产成本。我们先前已经专利技术了一种双链核酸微阵列制备技术(中华人民共和国国家专利申请号02112780.8)，但其生产成本仍然较高，
技术实现思路
(1)专利技术目的本专利技术的目的是提供一种便于在普通设备条件下固相支持物表面制备双链核酸的方法，而且制备成本低、双链核酸的碱基错配率较单纯互补单链核酸复性制备双链核酸的方法低。可以用来在固相支持物表面生产价值更大的单碱基突变双链核酸。(2)技术方案本专利技术是，其特征在于该制备方法包括如下步骤(a)化学合成两种单链寡核苷酸片段，其中一个为通用单链寡核苷酸片段，该单链寡核苷酸片段5′端含有两段反向碱基互补序列，3′端含有一段突出的单链寡核苷酸片段，在两段反向碱基互补序列中间间隔C6胺化的脱氧胸腺嘧啶核苷酸；另外一个为探针单链寡核苷酸片段，该单链寡核苷酸片段3′端含有一段能够与通用单链寡核苷酸片段3′端突出的单链寡核苷酸片段碱基完全互补的单链寡核苷酸片段；(b)在液相反应体系中将该通用单链寡核苷酸片段与探针单链寡核苷酸复性并进行核酸连接酶连接反应，从而形成在3′端带有发卡结构的单分子核酸样品；(c)将单分子核酸样品点样到表面被醛基修饰的固相支持物表面，经胺化的脱氧胸腺嘧啶核苷酸将单分子核酸连接在固相支持物表面；(d)寡核苷酸微阵列经核酸聚合酶延伸反应，填平固定的单分子核酸的单链寡核苷酸部分，在支持物表面合成完整的双链核酸分子。固定的单链寡核苷酸片段包括核糖核酸和脱氧核糖核酸两类核酸；用于进行核苷酸聚合反应的核酸聚合酶包括核糖核酸聚合酶、脱氧核糖核酸聚合酶及反转录酶；用于进行核苷酸聚合反应的核苷酸包括所有核糖核苷酸、所有脱氧核糖核苷酸及特殊稀有核苷酸；用于固定单链寡核苷酸的固相支持物包括可用于表面化学研究的拥有刚性和半刚性表面的材料。(3)技术效果本专利技术提出的固相支持物表面双链核酸制备方法在标准化、批量化生产上具有三点重要价值一是提出的固相支持物表面双链核酸制备方法依靠合成的特定的通用寡核苷酸本身的特点与探针单链寡核苷酸进行液相互补序列退火与连接反应，形成含有部分双链核酸的特定单分子寡核苷酸，这种特定单分子寡核苷酸能够依靠自身携带的C6胺化的脱氧胸腺嘧啶核苷酸结合到醛基修饰的固相支持物表面，再通过聚合酶延伸反应填平固定的单分子寡核苷酸的单链部分，从而在固相支持物表面合成完整的双链核酸；这种方法若用于在固相支持物表面生产双链核酸微阵列，则能极大地交底生产成本，提高生产效率；本专利技术提出的固相支持物表面双链核酸生产中，只需在一次性合成的通用寡核苷酸基础上合成多用途单链探针寡核苷酸(如含有DNA结合蛋白结合位点的单链探针寡核苷酸)，就可以经过简单的核酸复性、核酸连接、芯片点样和核酸聚合酶延伸反应四个常规实验，即可大量生产多用途双链寡核苷酸微阵列；二是本专利技术提出固相支持物表面双链核酸制备方法通过核酸聚合酶延伸合成双链核酸，由于核酸聚合酶的保真性、进行性较化学合成的高，因此对于较长或含有简并核苷酸的核酸片段合成具有重要意义；三是本专利技术提出的固相支持物表面双链核酸微合成方法，能够保证合成的双链核酸中极低的碱基错配率，这对于生产具有更大商业价值的固相支持物表面单碱基突变双链核酸具有非常重要的价值；这一方法能够克服高价合成一套与在片合成的单链核酸互补的单链核酸却不能通过杂交复性的方法生产具有单碱基突变特征的双链核酸的致命缺陷。本专利技术提出的固相支持物表面双链核酸制备方法对DNA结合蛋白的研究尤其具有重要价值。DNA与蛋白质的相互作用在基因组稳定性维持及基因表达调控中发挥着极其重要的作用，特别是序列特异性DNA结合蛋白，这类蛋白质虽然只占细胞核总蛋白的不到0.1％，但这类蛋白质常常是包括转录因子在内的调控基因以一定的时空性、数量性表达的重要反式作用因子，它们通过自己特殊的结构如亮氨酸拉链、锌指结构等基因组中序列特异性双链DNA识别结合，精确调节一类本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在固相支持物表面制备双链核酸的方法，其特征在于该制备方法包括如下步骤：（ａ）化学合成两种单链寡核苷酸片段，其中一个为通用单链寡核苷酸片段，该单链寡核苷酸片段５′端含有两段反向碱基互补序列，３′端含有一段突出的单链寡核苷酸片段，在两段 反向碱基互补序列中间间隔Ｃ６胺化的脱氧胸腺嘧啶核苷酸；另外一个为探针单链寡核苷酸片段，该单链寡核苷酸片段３′端含有一段能够与通用单链寡核苷酸片段３′端突出的单链寡核苷酸片段碱基完全互补的单链寡核苷酸片段；（ｂ）在液相反应体系中将该通用单 链寡核苷酸片段与探针单链寡核苷酸复性并进行核酸连接酶连接反应，从而形成在３′端带有发卡结构的单分子核酸样品；（ｃ）将单分子核酸样品点样到表面被醛基修饰的固相支持物表面，经胺化的脱氧胸腺嘧啶核苷酸将单分子核酸连接在固相支持物表面；（ｄ ）寡核苷酸微阵列经核酸聚合酶延伸反应，填平固定的单分子核酸的单链寡核苷酸部分，在支持物表面合成完整的双链核酸分子。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王进科，白云飞，陆祖宏，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]