复合糖的生产制造技术

公开了用于在细菌生产细胞中制备复合糖的组合物和方法。能制备的复合糖包括起源于细菌或起源于哺乳动物的寡糖和多糖。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种在革兰氏阴性细菌中在脂多糖(LPS)骨架结构上产生复合糖的方法。
技术介绍
复合糖存在于自然界中，且与范围广阔的一系列生物学功能有关；所述的生物学功能包括病毒、细菌以及真菌的发病机理，细胞与细胞的识别及细胞内的识别，激素和病原体与细胞表面受体的结合以及抗原-抗体识别。术语“复合糖”包括范围广阔的一系列具有通式(CH2O)n的化合物，在所述通式里，该单体单位选自许许多多天然存在的单体或合成的单体的任何一种；所述单体包括但不限于葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖以及唾液酸。除了碳-氢-氧核心外，糖类可以有诸如氨基、硫酸酯基或磷酸酯基之类的附加成分。把由二至十个糖单位组成的聚合物称为寡糖(OS)，且将由多于十个糖单位组成的聚合物称为多糖(PS)。可以以至少10种不同的方式连接这些单糖结构单元，从而导致天文学数值的不同组合与排列。人们发现种内的菌株在复合糖结构方面是不同的；且甚至在一种生物内的组织，在复合糖结构方面也不同。天然存在的复合糖的这种高度的变异性、高度特异性组成以及宽广范围的生物学作用，使得这些化合物特别重要。革兰氏阴性细菌有含复合糖，这些复合糖被连接到脂质上，从而形成脂寡糖(LOS)和脂多糖(LPS)。LOS和LPS的免疫源性存在于糖类部分，而致病性存在于脂质部分。为此，OS和PS可用作抗革兰氏阴性病原体的疫苗，且OS和PS可用于革兰氏阴性细菌的鉴定。美国专利申请5,736,533公开了可用作抗呼吸感染病原体的治疗剂的寡糖。人们认为致病菌能通过结合组织表面的糖类而在组织中建群，且提供过量的特定可溶性寡糖可导致对细菌建群的竞争性抑制。通过在培养物中培养特定的细菌病原体，可以由LOS和LPS生产OS和PS，随后切割去脂质部分且纯化。但是，大多数致病菌在其生长要求方面是苛求的，且生长缓慢；从而使这种生产方式不切实际。例如，已知流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)需要二氧化碳环境和脑/心提取物以进行生长。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)在OS和PS生产所需要的肉汤培养物中生长得非常差。另外，这些细菌病原体中的许多菌(例如脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis))以大体积的方式生长可能是危险的，因为有气溶胶和可能的传染病传播的危险。在诸如大肠杆菌(Escherichia coli)和明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)之类的快速生长至高密度的细菌菌株中，生产苛求菌病原体之OS和PS结构的能力则提供一种由苛求菌病原体生产这些OS和PS的快速方式。真核生物的蛋白和肽通常在其表面具有糖类部分，所述糖类部分作为激素的特异性结合位点而起作用；所述激素同样是糖基化了的，即具有连接到所述肽结构的复合糖。而且，除了所述的识别作用外，对于多肽正确地三维折叠成有功能的糖蛋白，糖类是必需的。细菌不能有效地肽和蛋白糖基化，或不以等同于真核生物糖基化的方式使肽和蛋白糖基化。为此，虽然广泛地将细菌用作产生真核生物肽和蛋白的生产细胞，但这样有用的人糖肽、例如红细胞生成素在哺乳动物细胞中生产。美国专利申请4,703,008号公开了一种用于生产红细胞生成素的方法，在该方法中，用编码该激素的DNA转染诸如中国仓鼠卵巢细胞之类的细胞，且在二氧化碳环境下于完全培养基中培养所述的细胞。所产生的激素与天然存在的激素足够相似，以致可有效地作为一种人用治疗剂。分离出的细胞特异性糖类的另外一种效用是对疾病因子的竞争性抑制，在所述的疾病因子方面，感染依赖于糖基化蛋白的表面识别。例如，已知人免疫缺陷病毒与T-4淋巴细胞上的表面受体结合。如果过量的游离T-4受体糖类存在于患者的体液中，则该病毒将与游离的糖类结合，从而有效地阻止该病毒感染T-4淋巴细胞。在治疗诸如红斑狼疮、多发性硬化以及类风湿性关节炎之类的自身免疫疾病方面，通过给予识别细胞之分子而竞争性抑制抗体与细胞表面结合可具有治疗的潜能。这样的分子可结合到细胞受体上，从而阻断在这样的疾病状态中引起所看到之变性的自身免疫抗体的结合。第4,745,051号美国专利公开了在一种昆虫细胞中表达DNA的方法，即对于糖基化肽和糖基化蛋白的生产具有实际用途的一种方法。然而，所产生的糖基化是该昆虫天然的糖基化；与哺乳动物细胞的典型糖基化产物相比，该昆虫细胞的糖基化产物含有较高含量的甘露糖。在细菌生产细胞中的肽和多肽的实际生产已经很好地建立了。在本领域中，使肽及蛋白糖基化的化学法和酶法是众所周知的。例如，美国专利5,370,872公开了一种将PS通过羧基或羟基偶联到蛋白上的方法。长期以来已经知道复合糖的传统有机合成，但是它们的实际应用则有限。除了在糖聚合物分子的复杂性方面所固有的困难外，许多糖苷键是不稳定的，且在化学合成期间必须保护与去保护，从而增加合成的困难及减少产物的收率。因为有机合成的这些缺点，所以设计了酶促合成。人们知道由于像糖基转移酶(glycotransferases)那样酶的作用，通过逐步地添加单体而进行糖基化作用。可以用裂合酶、乙酰基转移酶、硫酸酯酶、磷酸化酶、激酶、差向异构酶、甲基化酶、转移酶等等来进一步修饰所述反应的产物。美国专利5,308,460号公开了在一种固定化基质上的这样的分步合成。仍然需要一种效率更高且更实用的复合糖以及含有物种或组织特异性的复合糖之糖蛋白与糖肽的生产方法。专利技术概述本专利技术涉及在一种生产细胞中生产复合糖。本文公开了例如大肠杆菌菌株K-12的某些细菌有一种具有一种末端庚糖的核心脂糖(liposaccharide)。一种合适的生产细胞也包含一种酶，该酶催化到受体分子(例如N-乙酰葡糖胺)末端庚糖的转移，从而形成一种“支架”；糖基转移酶在所述的“支架”上添加其它的糖类单体而形成复合糖。如果另外一种合适的生产细胞没有这样的一种酶，则可以将编码流感嗜血菌之基因rfe(UDP-GlcNAc十一萜醇GlcNAc-1磷酸转移酶)的DNA插入到该生产细胞中。最好是由于存在基因lsgG的基因产物而提高rfe的产量。通过将编码糖基转移酶的基因插入到所述的生产细胞中去，而生产细菌特异性的复合糖；所述的细菌例如流感嗜血菌、种名未定的奈瑟氏球菌(Neisseria spp)、种名未定的沙门氏菌(Saimonella spp)以及大肠杆菌。同样，可以生产哺乳动物的复合糖，例如多聚唾液酸(polysialyl)。因此，本专利技术提供一种用于生产复合糖的方法，所述方法包括下列步骤，即(a)把经转化的生产细胞接种到一种能够支持所述生产细胞生长的培养基中；其中通过转化细菌，将一种分离出的、编码合成复合糖的糖基转移酶的DNA序列插入到所述细菌中而产生经转化的生产细胞，从而制备所述的生产细胞；所述的细菌包含(i)一种含有末端庚糖的核心脂质结构、以及(ii)能够添加一种受体分子到所述庚糖分子上的一种酶；(b)让所述经转化的生产细胞生长；以及(c)从所述培养物中回收所述复合糖。本专利技术也提供一种用于生产寡糖的方法，所述方法包括下列步骤，即(a)转化革兰氏阴性细菌，所述细菌包括(i)一种含有末端庚糖的核心脂质结构、以及(ii)添加一个半乳糖分子到所述庚糖上的一种酶；其中通过构建一种包含一种编码合成寡糖的糖基转移酶的分离本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于生产复合糖的方法，所述方法包括下列的步骤：（ａ）把经转化的生产细胞接种到一种能够支持所述生产细胞生长的培养基中，其中通过转化细菌，将编码合成复合糖的糖基转移酶的分离的ＤＮＡ序列插入到所述细菌中而产生经转化的生产细胞，从而制备所述生产细胞；所述细菌包括（ｉ）一种含有末端庚糖分子的核心脂质结构、以及（ｉｉ）能够添加一种受体分子到所述庚糖分子上的一种酶；（ｂ）让所述经转化的生产细胞生长；（ｃ）从所述培养物中回收所述复合糖。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：MA阿皮塞拉，BW吉布森，NJ菲利普斯，
申请(专利权)人：衣阿华研究基金大学，加州大学评议会，
类型：发明
国别省市：US[]