神经营养因子的生产方法技术

本发明专利技术公开了一种神经营养因子的生产方法。它通过计算机辅助设计，对人睫状神经营养因子的基因进行修饰改造，获得改造后突变人睫状神经营养因子基因的ｃＤＮＡ，人工合成该ｃＤＮＡ，构建重组质粒，转化大肠杆菌，经全自动发酵罐高密度表达；以切向流超滤方式进行复性；以离子交换层析、疏水层析和分子筛层析顺序组合纯化，生产得到高纯度的睫状神经营养因子。本发明专利技术的优点：１）采用计算机辅助设计，对天然密码子进行了优化，实现了突变体在大肠杆菌中的稳定高表达。２）采用切向流超滤方式复性，可减少超滤过程中的极化现象。３）离子交换层析、疏水层析和分子筛层析三种不同分离机理层析顺序组合，使复性后的ＣＮＴＦ得以纯化精制，其纯度均大于９５％。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及。
技术介绍
CNTF最早是在体外发现具有促进鸡胚睫状神经节的存活而被发现的(Manthorpe et al.，1980，J.Neurochem.3469-75)，在以后的几十年中，又有许多相关的生物学功能被发现。Hughes等发现它能促进围产期鼠视觉和脑神经中的神经胶质祖细胞分化(Hughes et al.，1988，Nature 33570-73)，而且还发现能促进鸡胚背根神经节的生长(Skaper and Varon，1986，Brain Res.38939-46)。此外，他还能促进运动神经元、海马神经元及副交感脊髓神经元的生长和分化(Ip，et al.1991，J.Neurosci.113124-3134；Blottner，et al.1989，Neurosci.Lett.105316-320)。鉴于rhCNTF的多种生物学功能，因此他被认为在修复神经损伤、治疗神经萎缩性疾病中能起到一定的作用，因此具有较好的临床应用前景。在进一步的研究中也发现，CNTF在治疗肥胖症，特别是Leptin耐受的肥胖症中也能起作用，显示了可能的临床用途(Isabelle Gloaguen，et al.1997，美国国家科学院院报)。因此，开发一种能高活性、低成本的生产rhCNTF的方法将极具有实用意义。CNTF曾被细菌系统克隆并表达(Masiakowski，et al.1991，J.Neurosci.571003-1012；Annalise Di Marco et al.1996，美国国家科学院院报)，但这些方法都只适用于制备少量样品进行科学研究，而不适合用于大规模制备。
技术实现思路
本专利技术的目的是提出一种适合于工业化生产的简便、快速、高活性回收率的是通过计算机辅助设计，对人睫状神经营养因子的基因进行修饰改造，获得改造后突变人睫状神经营养因子基因的cDNA，人工合成该cDNA，构建重组质粒，转化大肠杆菌，经全自动发酵罐高密度表达；以切向流超滤方式进行复性；以离子交换层析、疏水层析和分子筛层析顺序组合纯化，生产得到高纯度的睫状神经营养因子。本专利技术的优点1)采用计算机辅助设计，对天然密码子进行了优化，实现了突变体在大肠杆菌中的稳定高表达。2)采用切向流超滤方式复性，可减少超滤过程中的极化现象，复性处于可控制变性剂去除速度的过程上，缩短复性时间，使得复性收率高达70％，一次性复规模可达1-10g，所用的超滤材料便于NaOH进行原位清洗和消毒，可适应药物蛋白开发生产的GMP要求。同时采用此复性方式，还可在复性完成后，直接调整泵的流量差，而将大体积蛋白溶液进行浓缩，以便于后续纯化工艺操作的方便与省时。3)离子交换层析、疏水层析和分子筛层析三种不同分离机理层析顺序组合，使复性后的CNTF得以纯化精制，经反相高效液相层析(HPLC-RP)及毛细管电泳(CE)检测，其纯度均大于95％。附图说明图1是人工合成的突变CNTF cDNA序列图；图2是CNTF重组质粒结构图；图3是复性装置示意图，图中1贮罐、2复性反应器、3搅拌器、4超滤膜包、5蠕动泵、6废液缸。具体实施例方式为了提高CNTF蛋白的稳定性和生物学活性，与天然人CNTF相比，对一级结构进行了改变，其特征是第17位半胱氨酸变为丙氨酸(Cys17→Ala17)，第63位谷氨酸变为精氨酸(Gln63→Arg63)，并去掉末端15个氨基酸。同时针对大肠杆菌密码子偏爱与人不同的特性，将CNTF基因序列进行优化设计。具体而言就是将CNTF天然基因序列中每一个氨基酸所对应的密码子改造为大肠杆菌所偏爱的密码子，同时考虑整个基因序列的G+C/A+T比例平衡，并在基因5’端、3’端及中间分别引入特定的酶切位点，如XhoI，EcoRI，AflIII以方便后续克隆、拼接。基于密码子的摆动学说，我们所指的CNTF基因序列设计还可以有许多变动延伸。而不仅限于图一所列的序列。然后，根据基因片段人工合成的需要，将设计的CNTF基因分段合成，体外拼接成完整的序列。拼接好的CNTF序列，测序正确后扩增获得较多CNTF cDNA，并构建于依赖T7RNA聚合酶的表达载体pGENS成为表达型重组体pGENS CNTF，转化E.coli BL21(DE3)plysS，筛选后获得表达CNTF的阳性克隆，经发酵、离心收集、匀浆破碎后得到含目的蛋白的包含体。以上克隆、转化、筛选工作都为常规分子生物学技术，具体请参阅《MolecularCloning》J.Sambrook等著；《Short Protocols in Molecular Biology》FrederickM.Ausubel等著，以及其它分子生物学实验技术参考书。根据图3，组成复性装置，采用截留分子量为3000-10000的超滤膜包或外压式中空纤维柱，以切向流方式组合。其中材料超滤膜是醋酸纤维素酯、硝酸纤维素酯、偏四氟乙烯或聚砜。将待复性蛋白及起始复性液置于复性反应器中，用蠕动泵抽出蛋白液，流经超滤膜功能层侧，变性剂因超滤作用透过超滤膜并注入废液缸，而蛋白则应其分子量较大，无法穿过超滤膜，沿膜壁侧重新回到复性反应器中，同时以同样速度将贮液注入复性反应器，使反应器内体积维持恒定，经不断循环，反应器中变性剂浓度逐步下降，变性蛋白在温和的条件下完成水合表面的脱水过程和折叠过程，直至复性。复性后蛋白仍含有杂蛋白、热源、核酸，须进一步去除，本专利技术设计了离子交换、层析接疏水层析，后接分子筛层析的顺序组合。离子交换层析填料为DEAE，Q或QAE阴离子交换剂。CNTF等电点介于5.8-6.2，pH适于7.0-9.0，可选用20-50mM咪唑盐酸、巴比妥盐酸、Tris盐酸、硼砂-硼酸或磷酸缓冲液，pH的范围在7.0-9.0，为流动相。也可直接以复性时稀释液作为上样平衡液，平衡离子交换柱，尔后将复性浓缩好的CNTF蛋白溶液直接上样，并以上述相应的流动相加0.01-0.5NaCl梯度进行洗脱，通过离子交换层析，可将复性过程产生的错误折叠的CNTF蛋白以及部分等电点与CNTF不一致的杂蛋白去除，同时，也可去除相当一部分的宿主DNA片段。疏水柱选用butyl-，phenyl-或octyl基的疏水填料，可选用20-50mM Tris盐酸、咪唑-盐酸缓冲液或磷酸缓冲液，pH的范围在6.0-9.0，加入0.4-1.6mol/L(NH4)2SO4或0.4-1.8mol/L Na2SO4为流动相A，以不含(NH4)2SO4或Na2SO4的缓冲液为流动相B。将离子交换收集的目标峰直接补加0.4-1.6mol/L(NH4)2SO4或0.4-1.8mol/L Na2SO4，即可上样于疏水柱，然后以上述流动相加0.1-1.0N(NH4)2SO4或Na2SO4平衡柱子，上样结束后以起始缓冲液冲洗将核酸及热原被充分洗脱，尔后以20-50mM，pH7.0-9.0，Tris盐酸缓冲液或咪唑缓冲液及水顺序地阶段洗脱。CNTF目标峰在Tris盐酸或咪唑-盐酸缓冲液的洗脱峰中。经疏水层析后收集的目标峰，可直接上样于以5-50mM磷酸盐为流动相平衡好的Sephacryl或Superdex分子筛层析柱，进行精制。本专利技术所用此方法旨在将可能存在的寡聚体及降解蛋白进一步去除的同时本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种神经营养因子的生产方法，其特征在于通过计算机辅助设计，对人睫状神经营养因子的基因进行修饰改造，获得改造后突变人睫状神经营养因子基因的ｃＤＮＡ，人工合成该ｃＤＮＡ，构建重组质粒，转化大肠杆菌，经全自动发酵罐高密度表达；以切向流超滤方式进行复性；以离子交换层析、疏水层析和分子筛层析顺序组合纯化，生产得到高纯度的睫状神经营养因子。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄岩山，王昌梅，裘霁宛，李辉，孙瑛，邹晔，孙汉栋，丁海，
申请(专利权)人：杭州九源基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]