可逆光致变色藻胆蛋白的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种可逆光致变色藻胆蛋白的制备方法，通过基因工程表达可逆光致变色藻胆蛋白的脱辅基蛋白、相应的催化藻蓝胆素从藻蓝蛋白裂解的藻蓝蛋白裂合酶、相应的催化藻胆蛋白脱辅基蛋白与藻胆色素共价偶联的藻红蓝蛋白裂合／异构酶，然后应用此裂合酶、此裂合／异构酶催化藻蓝胆素从藻蓝蛋白及其α亚基转移，并同时与藻胆蛋白脱辅基蛋白体外重组，从而制备可逆光致变色的藻胆蛋白。本发明专利技术方法中，整个反应过程不涉及使用有机溶剂和去污剂，只使用蛋白质与水溶液，是一种环境友好的绿色生产工艺。因此，此可逆光致变色藻胆蛋白制备方法更适合应用于食品、保健与医药功能领域中。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于生物技术中色素蛋白质材料领域，具体涉及。当蓝藻中存在PEC时，其基因组中必定存在PEC操纵子(简称pec)，pec中含B、A、C、E、F五个基因，分别称为pecB、pecA、pecC、pecE、pecF。其中pecA编码PecA，PecA为α-PEC的脱辅基蛋白，共有162个氨基酸，分子量为18kDa(盛树斌，马晓军，霍海蓉，赵开弘，藻红蓝α亚基脱辅基蛋白基因的克隆和表达，武汉大学学报(自然科学版)，1999，45(4)，493～496)。pecE与pecF分别编码PecE与PecF(简称PecE/F)，PecE/PecF催化藻胆蛋白脱辅基蛋白与藻胆色素的共价偶联反应，是α-PEC生物合成的裂合/异构酶(lyase/isomerase)(盛树斌，张富铁，邓明刚，周明，赵开弘，层理鞭枝藻藻红蓝蛋白E基因片段的克隆与表达，水生生物学报，2001，25(4)，427～430。郑敏，答亮，邓明刚，秦艺曼，周明，赵开弘，层理鞭枝藻藻红蓝蛋白操纵子F基因的克隆和表达，水生生物学报，2002，26(2)，168～174)。PecE/PecF催化PCB异构化为PVB，并与PecA的84位半胱氨酸巯基以硫醚键共价连接，从而生成具有天然活性的α-PEC。当蓝藻中存在PC时，其基因组中必定存在PC操纵子(简称pc)，pc中的E、F基因(即pcE、pcF)，与pecE、pecF类似，编码PcE与PcF(简称PcE/F)，PcE/PcF催化α-PC的脱辅基蛋白(即PcA)与PCB的共价偶联反应，是α-PC生物合成的裂合酶(lyase)。PcE/PcF即可以催化PCB与PcA的84位半胱氨酸巯基以硫醚键共价连接，从而生成具有天然活性的α-PC，也可以催化其中的PCB从PC或α-PC裂解断开。本专利就是利用PcE/F裂合酶的裂解性质，应用PcE/F从PC或α-PC断裂得到PCB，然后同时生成的PCB被PecE/F催化，与α-PEC类脱辅基蛋白共价结合，得到可逆光致变色的藻胆蛋白。藻胆蛋白可以应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域。目前使用的藻胆蛋白仍局限于从藻中提取。α-PEC具有可逆光致变色性质，为了发展可逆光致变色的藻胆蛋白类色素蛋白质功能材料，可以分子设计和体外重组可逆光致变色藻胆蛋白。应用本专利介绍的方法可以不使用任何有机溶剂和去污剂，通过生物工程生产藻胆蛋白脱辅基蛋白、藻蓝蛋白裂合酶、藻红蓝蛋白裂合/异构酶，然后应用这些酶的催化性质，制备可逆光致变色的藻胆蛋白。因此，本方法为藻胆蛋白类色素蛋白质功能材料应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域奠定了基础。为实现上述专利技术目的一种，其步骤为一种，其步骤为(1)采用基因工程方法，分别将pecE和pecF克隆于表达载体中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecE与PecF；(2)将PecE与PecF混合，得到藻红蓝蛋白裂合/异构酶PecE/F；(3)采用基因工程方法，分别将pcE和pcF克隆于表达载体中，将此表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF；(4)将PcE与PcF混合，得到藻蓝蛋白裂合酶PcE/F；(5)应用基因工程方法表达PecA类脱辅基蛋白；(6)将步骤2得到的PecE/F、步骤4得到的PcE/F、步骤5得到的脱辅基蛋白与PC或α-PC混合，按如下反应条件反应反应温度20～45℃，pH值7～8.5；反应所需的辅助因子包括①二价锰离子、镁离子或钙离子中的一种或几种，其总浓度为1～5mmol/L，和②巯基乙醇、二硫苏糖醇、还原型谷胱甘肽或其它巯基化合物中的一种或几种，其总浓度为2～10mmol/L。在现有的可逆光致变色藻胆蛋白制备方法中，由于使用藻蓝胆素这种胆色素小分子，所以需要使用有机溶剂和去污剂(周明，王鲁，郑雷，赵开弘，藻红蓝蛋白连接/异构酶重组体系，华中科技大学学报(自然科学版)，2002，30(8)，114～116)。本专利技术描述了使用藻蓝蛋白而不是藻蓝胆素作反应物，应用克隆表达的藻蓝蛋白裂合酶、藻红蓝蛋白裂合/异构酶同时催化藻蓝蛋白中的藻蓝胆素转移，并与藻胆蛋白脱辅基蛋白重组，从而生成可逆光致变色的藻胆蛋白。本专利技术方法中，整个反应过程不涉及使用有机溶剂和去污剂，只使用蛋白质与水溶液。因此，此种可逆光致变色藻胆蛋白制备方法更适合应用于食品、保健与医药功能领域中。可以应用吸收光谱检测如此制备的可逆光致变色藻胆蛋白(见说明书附图)。对于本专利技术所得到的可逆光致变色藻胆蛋白，当用500nm光辐射时，表现为565nm吸收增强；当用570nm光辐射时，表现为505nm吸收增强，即可逆光致变色范围505565nm。本专利技术方法中，整个反应过程不涉及使用有机溶剂和去污剂，只使用蛋白质与水溶液，是一种环境友好的绿色生产工艺。因此，此种可逆光致变色藻胆蛋白制备方法更适合应用于食品、保健与医药功能领域中。实施例1(1)分别将Gene bank中编号为M75599的pecE、pecF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecE与PecF。如此生产的PecE与PecF具有6个组氨酸构成的亲和标记，因此，这里可以应用与该亲和标记匹配的金属离子螯合亲和层析柱分离提纯PecE与PecF。(2)将PecE与PecF混合，得到藻红蓝蛋白裂合/异构酶PecE/F。(3)分别将Gene bank中编号为AF506031的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。如此生产的PcE与PcF具有6个组氨酸构成的亲和标记，因此，这里可以应用与该亲和标记匹配的金属离子螯合亲和层析柱分离提纯PcE与PcF。(4)将PcE与PcF混合，得到藻蓝蛋白裂合酶PcE/F。(5)将Gene bank中编号为M34254的pecA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecA。如此生产的PecA具有6个组氨酸构成的亲和标记，因此，这里可以应用与该亲和标记匹配的金属离子螯合亲和层析柱分离提纯PecA。(6)将步骤2得到的PecE/F、步骤4得到的PcE/F、步骤5得到的脱辅基蛋白PecA与PC混合，按如下反应条件反应反应温度37度，pH值7.5；反应所需的辅助因子①3mmol/L的二价锰离子，或5mmol/L的镁离子，和②5mmol/L的巯基乙醇。反应得到可逆光致变色藻胆蛋白PecA-PVB。实施例2(1)分别将Gene bank中编号为M75599的pecE、pecF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PecE与PecF。如此生产的PecE与PecF具有6个组氨酸构成的亲和标记，因此，这里可以应用与该亲和标记匹配的金属离子螯合亲和层析柱分离提纯PecE与PecF。(2)将PecE与PecF混合，得到藻红蓝蛋白裂合/异构酶Pe本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可逆光致变色藻胆蛋白的制备方法，其步骤为：（１）采用基因工程方法，分别将ｐｅｃＥ和ｐｅｃＦ克隆于表达载体中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产ＰｅｃＥ与ＰｅｃＦ；（２）将ＰｅｃＥ与Ｐ ｅｃＦ混合，得到藻红蓝蛋白裂合／异构酶ＰｅｃＥ／Ｆ；（３）采用基因工程方法，分别将ｐｃＥ和ｐｃＦ克隆于表达载体中，将此表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产ＰｃＥ与ＰｃＦ；（４）将ＰｃＥ与ＰｃＦ混合 ，得到藻蓝蛋白裂合酶ＰｃＥ／Ｆ；（５）应用基因工程方法表达ＰｅｃＡ类脱辅基蛋白；（６）将步骤２得到的ＰｅｃＥ／Ｆ、步骤４得到的ＰｃＥ／Ｆ、步骤５得到的脱辅基蛋白与ＰＣ或α－ＰＣ混合，按如下反应条件反应：反应温度２０～４５℃，ｐＨ值７ ～８．５；反应所需的辅助因子包括：①二价锰离子、镁离子或钙离子中的一种或几种，其总浓度为１～５ｍｍｏｌ／Ｌ，和②巯基乙醇、二硫苏糖醇、还原型谷胱甘肽或其它巯基化合物中的一种或几种，其总浓度为２～１０ｍｍｏｌ／Ｌ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵开弘，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]