一种嵌合基因的构建方法及其应用技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，公开了一种嵌合基因的构建方法，其氨基酸序列的连接方向为第一链的氨基端→羧基端→链接区→第二链的羧基端→氨基端，其中的一条链和传统人工合成蛋白的方向相反，传统方法的方向为第一链的氨基端→羧基端→链接区→第二链的氨基端→羧基端的序列，本发明专利技术序列的连接方式类似生物体内天然存在的状况，有更多的自由氨基端，有利于与受体和配基的自由组合，促进构建全新分子的研究。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，涉及基因工程中一种嵌合基因的构建方法，其氨基酸序列连接的方向有一部分和传统的方向相反，有更多的自由氨基端，类似生物体内天然存在的状况，促进构建全新的分子的研究。利用现有的方法只能将受体的亚单位通过链接区将第1部分的羧基端和第2部分的氨基端相连，而在人体内受体的亚单位的氨基端是自由结合的，没有任何的限制。同样利用现有的方法构建重组抗体的过程中，只能将一种蛋白的某一段基因片段，称为第一链的羧基端通过链接区与同种或另一种蛋白的某一段基因片段，称为第二链的氨基端相连，而使形成的人工分子的氨基端区域受到限制；而利用现有的方法构建的核苷酸序列如图2所示即第一链的氨基端→羧基端→链接区→第二链的氨基端→羧基端，其氨基端是自由的，没有任何的限制。为了实现本专利技术的目的采取的方案1、一种嵌合基因的构建方法，在氨基酸序列合成时第一(或第二)链的方向为氨基端到羧基端通过链接区链接第二(或第一)链，其特征是所述的第一链和第二链在合成时都以羧基端和链接区相连，所述的第二(或第一)链方向为羧基端到氨基端；形成一条完整的DNA链的嵌合基因序列的方向为第一(或第二)链的氨基端—羧基端—链接区一第二(或第一)链的羧基端—氨基端这样的序列。2、所述的第一链和第二链构建成嵌合基因的基因片段，是同种蛋白基因的全部基因或部分基因或是来自不同蛋白的基因片段，是来自生物体内或是人工合成的基因片段；是确切的核苷酸序列，或是随机的核苷酸序列。3、所述的链接区由0-2000个氨基酸构成，其最佳长度为1-40个氨基酸序列，一般为苷氨酸和丝氨酸组成的链接序列。4、所述的第二链的氨基端加入一个琥珀终止密码子UAG，以使嵌合基因表达产物纯化。5、所述的琥珀终止密码子UAG的后面通过链接区连接噬菌体的基因片段，使其与外源性基因片段融合，并表达于噬菌体的表面，利于蛋白之间互相作用的深入研究。6、一种嵌合基因的构建方法的应用，通过逆转录一聚合酶链反应、拼接、测序和人工合成常见的分子生物学方法，证明用本专利技术的嵌合基因的构建方法所构成的嵌合基因，其特征是和生物体内天然存在的状况类似，有更多的自由氨基端，有利于其与受体和配基的自由结合，使羧基端的氨基酸先于氨基端的氨基酸，有利于细胞蛋白的合成，促进构建全新的分子的研究。通过对基因的人工合成，不仅可以根据所用细胞的兼并密码子的使用频率来调整基因的序列，以提高蛋白的翻译水平，同时也可以根据氨基酸的序列，利用分子生物学的手段，来构建编码蛋白分子的基因。传统的人工合成蛋白的基因片段具有方向性，即在细胞内复制、转录和翻译时，合成的方向只能从氨基的5’端到羧基的3’端，遵循这一原则，方能得到具有活性的产物。本专利技术所述的一种嵌合基因的构建方法，第一链和第二链都以羧基端和链接区相连，第二链的编码羧基端氨基酸的密码子位于传统人工合成基因的5’端，而编码氨基端氨基酸的密码子位于传统人工合成基因的3’端，使羧基端的氨基酸先于氨基端的氨基酸，利用细胞的蛋白合成机制来合成全新的分子，因为这种结构有更多的自由氨基端，使其与受体或配基结合时，充分自由结合，便于构建二聚体或多聚体，筛选到在体内具有高度活性的药物的深入研究。在本专利技术的嵌合基因构建的方法中，所述的链接区可以是任何氨基酸序列，由0-2000个氨基酸构成，其最佳长度为1-40个氨基酸序列；所述的第二链的氨基端加入一个琥珀终止密码子UAG，以利于嵌合基因表达产物的纯化。丝状噬菌体是一种细菌的病毒，它可以借助细菌的DNA和蛋白质合成机制，来完成自身的复制，并且不引起细菌的死亡。最常见和常用的丝状噬菌体为M13，fd等，其外形呈棒状。M13的基因组为一条单链DNA，其为10个基因编码。这10个基因编码的蛋白质，组成了包被单链DNA的外衣。整个噬菌体的分子量为1.63×107Da，其中88％为蛋白质，12％为DNA。整个包衣有大约2700份的主要包衣蛋白pVIII。在噬菌体的一端，有各为5个拷贝的基因VII和VI编码的蛋白，参与和细菌的结合以及结束噬菌体的装配过程。噬菌体的另一端为各为5个拷贝的基因VII和IX编码的分别为33个和32个氨基酸的蛋白，参与噬菌体装配的起始和噬菌体稳定性的维持。目前已经报道了分别用基因III，VI，VII，VIII和IX来显示抗体于噬菌体表面的报道。利用噬菌体的基因III，VI，VII， VIII或IX基因与外源性基因片段融合，可以使外源性基因编码的蛋白产物显示在噬菌体的表面，这样达到了基因型与表现型的统一。特别是利用体内外的筛选技术所获得的与受体或配基结合的噬菌体，直接可以从中分离出编码的基因片段，用于更进一步的研究。重组噬菌体抗体系统利用了M13噬菌体独特的生活周期，特别是在噬菌体表面表达的几个噬菌体蛋白的独特特性。丝状噬菌体M13长度约为895nm，直径为9nm。其为单链DNA，共有6407个碱基，为10个蛋白质编码。与其它的大多数细菌噬菌体不同的是，M13并不产生溶菌性的感染，而是在保持宿主存活的状态下，利用宿主的基因复制和蛋白合成机制来复制产生大量的噬菌体。在感染宿主的过程中蛋白III起着至关重要的作用，因为通过蛋白III与宿主细菌菌毛的结合，而使得噬菌体可以进入大肠杆菌体内。利用分子生物学方法，将抗体的相关基因片段通过与蛋白III或蛋白VIII等的融合，利用噬菌体的基因与外源性基因片段融合，使外源性基因编码的蛋白产物，表达于噬菌体的表面，而达到基因与功能的偶联，为研究蛋白之间的相互作用，开辟了一条新的途径。除了噬菌体以外，还有许多动物和人类的病毒、细菌、酵母和细胞被用来在其表面显示外源性的蛋白质。如葡萄球菌的蛋白A，脊髓灰质炎病毒，酵母的α因子等，用来与外源性的蛋白质组成融合蛋白，使外源性的蛋白质表达在其表面，同样可以通过筛选技术，达到基因型和表现型的统一。本专利技术的优点及应用本专利技术的嵌合基因的构建方法所构建的嵌合基因的表达产物，使羧基端的氨基酸先于氨基端的氨基酸，有更多的自由氨基端，有利于其与受体或配基的自由结合，和生物体内天然存在的结构相似，不受传统氨基酸序列方向的限制，有利于细胞蛋白的合成，促进构建全新的分子的研究。箭头为体内蛋白质合成的方向；1、2、椭圆为嵌合基因的第一链与第二链；3、基因片段的羧基端；4、7、线条为链接区；5、基因片段的氨基端；6、矩形为琥珀终止密码子；8、三角形为噬菌体的pIII(VI，VII，VIII或IX)基因所编码的蛋白片段。附图说明图1表示体内嵌合基因构建方向为第一链的氨基端→羧基端→链接区→第二链的羧基端→氨基端→琥珀终止密码子→链接区→噬菌体的pIII(VI，VII，VIII或IX)基因所编码的蛋白片段。图2表示传统人工方法基因的构建方向为第一链的氨基端→羧基端→链接区→第二链的氨基端→羧基端→琥珀终止密码子→链接区→噬菌体的pIII(VI，VII，VIII或IX)基因所编码的蛋白片段。2)用等量的磷酸缓冲液稀释外周血。3)为了分离血中的淋巴细胞，首先在各试管中加入3毫升淋巴细胞分离液(上海生化试剂厂)，然后在每个试管中从管壁轻轻加入5毫升稀释后的血液。4)置低速离心机，2500转/分钟，离心20分钟。5)此时可见试管中不同组分的条带，从上至下分别为血浆层(黄色)，淋巴细胞层本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嵌合基因的构建方法，在氨基酸序列合成时第一（或第二）链的方向为氨基端到羧基端通过链接区链接第二（或第一）链，其特征是所述的第一链和第二链在合成时都以羧基端和链接区相连，所述的第二（或第一）链方向为羧基端到氨基端；形成一条完整的ＤＮＡ链的嵌合基因序列的方向为：第一（或第二）链的氨基端→羧基端→链接区→第二（或第一）链的羧基端→氨基端。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘吉荣，迟云发，
申请(专利权)人：北京神洲天才科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]