基因重组肿瘤血管凋亡因子PFK及其衍生融合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及基因重组肿瘤血管凋亡因子ＰＦＫ及其衍生融合蛋白，以及它们的制备方法。首先从肝脏ＣＤＮＡ文库中用ＰＣＲ方法扩增Ｋ１基因，上游引物设计时增加ＰＦ４的活性片段，成为ＰＦＫ基因。然后利用酵母表达质粒ｐＰＩＣＺ区有１２个多克隆基因插入位点，首先将ＰＦＫ基因插入ＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩ位点，测序确认正确后，再在ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ位点插入第二个基因。接着可以在ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ位点插入第三个基因。通过ＰＦＫ与Ｋ１、Ｋ５、Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ等基因拼接，制备了多个融合基因。本发明专利技术的ＰＦＫ及其衍生融合蛋白易于在酵母中表达，易于纯化，具有良好活性，能够抑制肿瘤血管新生、阻断肿瘤发展的营养供给和新陈代谢。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及基因重组肿瘤血管凋亡因子PFK、其衍生融合蛋白以及它们的制备方法。目前，已经在研究中的肿瘤血管抑制药物有百余种，其中有30多种进入临床试验，有数种通过二期临床试验进入三期临床研究阶段。抑制肿瘤血管生成是继手术、放疗、化疗以后实现肿瘤治疗的新的肿瘤治疗途径与传统方法有良好的协同作用。这些肿瘤血管抑制药物大致可以分为两类一类是化学合成或半合成药物，这一类一般毒副反应较大，应用限制较多；另一类是人体内源性的血管生长抑制因子，如PF4(血小板因子4)(Gengrinovitch S.et alPF4 inhbits themitogenic activity of VEGF125and VEGF165 Using several concurrentmechanisms J.B.C.270.15059-15065 1995)，Angiostatin(血管抑素)(O’Relly，M.S.，Holmgren L，Yuen Shing et.al.AntiangiogenicA novelangiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metasis by a Lewis lungcarcinoma.Cell，1994，79315)，Endostatin(内皮抑素)(O’Relly M.S.et alEndostatinan endogenous inhibitor for of angiogenesis and tumor growth Cell1997 88 277)等，可以通过基因工程方法大量制备，这一类内源性抑制因子毒副反应小，可成为临床应用效果良好的抗肿瘤药物。人体内存在血管生长与血管生长抑制二个系统，正常成年人二个系统达到平衡。成年人血管内皮细胞寿命仅次于神经细胞，代谢速度很慢。妇女妊娠、月经周期、伤口愈合过程会发生血管新生，而在一般情况下以抑制为主。肿瘤细胞大量分泌血管生长因子，要实现血管抑制需要使用超过体内正常量大得多的抑制因子。如内源性血管生长抑制因子Angiostatin和Endostatin在动物试验中效果良好，副作用轻微，但用量则很大。从动物实验结果推算，人体用量每次注射需以克计。实际临床试验中，每次注射用量为100-350mg，是目前其他基因工程药物的1000倍以上。如果一个患者，每次用100mg，一个疗程30次，则总用量为3克；以100万人(一个疗程的用量)计算是300万克，即3000公斤，这是现有基因工程技术难以实现的。为此解决上述困难，可以从下述三个方面进行突破一是提高基因工程菌株的表达产量，以适应量的要求；二是优化蛋白质纯化方法，以适应超大规模制药的需要；三是提高药物活性，减少用量。1999年BOLANOWSKI申请了PCT(WO99/168889)Fusion ProteinsComprising Angiostain Moisty and Their Use in Ant-tunmor Treatmt 0.8.04.1999C12N-15/62 PCT/US98/20464.BOLANOWSKI专利将Angiostatin与EndostatinI型干扰素、Thromdospondin干扰素诱生蛋白10、PF4拼接，以实现融合蛋白的易于是纯化功能和提高活性能效果。该专利主要运用了Angiostatin，Angiostatin是J FoIkman在1994年发现的血管生长抑制因子，是血浆蛋白Plasminogen(纤溶酶原)的N端的片段，分子量为37-43KD。除抑制血管内皮细胞增殖以外，该蛋白与Plasminogen一样可被lysines-Sepharose4B柱吸附并被6氨基已酸特异洗脱，有易于纯化的特性。利用Angiostatin与Endostatin、PF4等有血管抑制功能的蛋白拼接成融合蛋白，二种异基因具有同功能的蛋白协同作用，提高活性。同时，融合蛋白将保留Angiostatin易于纯化的特点，这是血管生长抑制因子研究方面极好的设计。本专利技术是在BOLANOWSKI专利的基础上进行的，是对它的改进，BOLANOWSKI专利中的Anginstatin在酵母中难以表达，与其他基因拼接，更难实现商业化生产。本专利技术用Angiostatin的活性片段(K1片段)代替BOLANOWSKI专利的Angiostatin，这样分子量小三倍，易于分子改造。然后在K1片段前接上PF4的13个活性氨基酸片段，生成肿瘤血管凋亡因子PFK，肿瘤血管凋亡因子PFK可以干扰血管生内皮细胞生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)，从而提高对血管内皮细胞的抑制作用。最后，还可以在血管凋亡因子PFK的基础上进一步与K1、K5、Endostatin等拼接构建融合蛋白，进一步提高抑制活性。本专利技术的另一目的在于提供基因重组肿瘤血管凋亡因子PFK的衍生融合蛋白，以及它们的核苷酸序列和氨基酸序列。本专利技术的另一目的在于提供基因重组肿瘤血管凋亡因子PFK及其衍生融合蛋白的制备方法。本专利技术的目的是这样实现的一种基因重组肿瘤血管凋亡因子PFK的cDNA，它的核苷酸序列为SEQID No.3。它的氨基酸序列为SEQ ID No.4。一种制备基因重组肿瘤血管凋亡因子PFK的方法，其特征在于，包括从肝脏CDNA文库中用PCR方法扩增K1(Plasminogen Kringle 1)，并在其上游引物合成时加入血小板因子4(PF4)的13个氨基酸，用表达质粒pPICZαA转化寄主细胞，培养转化体，获得基因重组肿瘤血管凋亡因子PFK；所述的K1片段的核苷酸序列为SEQ ID No.1，所述的13个氨基酸片段的核苷酸序列为SEQ ID No.2。一种基因重组肿瘤血管凋亡因子PFK的衍生融合蛋白，其特征在于，它具有以下结构通式PFK-L-Px或PFK-L-Px-L-Py，其中通式中的Px、Py是有血管抑制功能的蛋白或功能片段，如PlasminogenKringle1(k1)，Plasminogen Kringle5(k5)、胶原十八C末端的有血管抑制活性片段Endostatin(En)、VEGFR、有血管抑制功能的催乳素片段等；通式的中L是连接两种蛋白的柔性连接臂，其核苷酸序列为SEQ ID No.5，所表达的蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID No.6。上述通式中的Px可为Kringle1(k1)，构成的衍生融合蛋白PFK-L-K1的核苷酸序列为SEQ ID No.7，它的氨基酸序列为SEQ ID No.8。上述通式中的Px可为Plasminogen Kringle 5(k5)，所述的K5基因的核苷酸序列为SEQ ID No.9，构成的衍生融合蛋白PFK-L-K5的核苷酸序列为SEQ ID No.10，它的氨基酸序列为SEQ ID No.11。上述通式中的Px可为Endostatin(En)，所述的En基因的核苷酸序列为SEQ ID No.12，构成的衍生融合蛋白PFK-L-En的核苷酸序列为SEQ IDNo.13，它的氨基酸序列为SEQ ID No.14。上述通式中的Px可为K1，Py为K5，构成的衍生融合蛋白PF本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因重组肿瘤血管凋亡因子ＰＦＫ的ｃＤＮＡ，其特征在于，它的核苷酸序列为ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谈立松，陈宇光，张尚权，
申请(专利权)人：谈立松，陈宇光，张尚权，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]