人γ-干扰素在毕赤酵母菌中的高效表达、发酵和纯化制造技术

设计并人工合成了特别适合于毕赤酵母菌（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）中表达的人γ－干扰素的基因序列，构建了胞内表达人γ－干扰素蛋白的载体ｐＰＩＣ３．５Ｋ－ｉｆｎ，采用蛋白酶缺陷的ＳＭＤ１１６３毕赤酵母菌（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）为宿主菌，用Ｇ４１８抗性浓度递增法筛选多拷贝克隆，得高表达克隆株ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＳＭＤ１１６３（ｐＰＩＣ３．５Ｋ－ｉｆｎ，ｈｉｓ４ｐｅｐ４Δｐｒｂ１）－１８１．该菌在２８－３０℃不含甲醇的培养基培养４８小时，再在含１％的甲醇的诱导培养基培养３６－４８小时，γ－干扰素表达量可达菌体总蛋白的２５％。每升含γ－干扰素初品约为１克左右。经ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ凝胶吸附，ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００分子筛层析，ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ阴离子交换层析，ＣＭ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ阳离子交换层析，得纯度为９７．５％以上（ＨＰＬＣ）的人γ－干扰素蛋白。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，更具体地说是涉及一种用DNA重组技术合成人γ-干扰素、含有该基因的重组载体、用该载体转化的宿主、以及利用转化体产生人γ-干扰素的发酵和纯化方法。
技术介绍
γ-干扰素(IFN-γ)是wheelock在1965年发现的，又称免疫型干扰素。它具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等生理作用，在临床上有着广泛的应用。天然人IFN-γ是由丝裂原、内毒素或外来抗原刺激T淋巴细胞产生的，含量很低且提纯困难，难以满足临床需要。目前临床上应用的人IFN-γ大都是采用DNA重组技术生产的。重组人γ-干扰素现有技术是由大肠杆菌(Escherichia coli.)作宿主菌用原核表达系统表达的。中国科学院上海生物化学研究所刘新垣等1994年用合成的人γ-干扰素cDNA在大肠杆菌中表达人γ-干扰素(见中国科学(B辑)，24(10)，1076-1084，1994；和中国专利94112091)。中国预防医学科学院病毒学研究所侯云德和卫生部上海生物制品研究所亦采用带有人γ-干扰素基因的杂交质粒pBV220转染大肠杆菌DH5α株，组建成表达工程菌(病毒学报，4，97，1988)。上述两表达菌株表达的人γ-干扰素最初皆是以包涵体形式存在，即表达产品不溶于水，人γ-干扰素蛋白为非天然折叠构象，需经包涵体复性等复杂步骤纯化处理(病毒学报，13，134-139，1997；微生物学报，33(4)，248-254，1993；生物工程学报，14(2)，203-207，1998)。由于原核表达体系的局限性和包涵体复性及纯化处理的复杂性，有时会造成表达的人γ-干扰素C端不均一缺失，分别丢失13、15、18个氨基酸残基，使基因工程表达的人γ-干扰素一级结构与天然的人γ-干扰素一级结构有很大差别(生物工程学报，10(1)，50-55，1994)。为克服现有技术存在之不足，设计寻找一种以毕赤酵母(Pichiapastoris)为宿主高效表达人γ-干扰素并进行发酵和纯化的新技术方法，具有一定的理论意义和十分重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是寻找一种人γ-干扰素基因在毕赤酵母菌(P.pastoris)中高效表达、发酵及纯化的新技术方法，以克服现有技术存在的不足。目前国内外市场上的人γ-干扰素工业化生产菌株皆采用大肠杆菌作为宿主表达。本专利技术采用甲醇诱导型酵母菌作为人γ-干扰素的工业化生产菌株。由于是真核酵母细胞的胞内表达，故表达获得的人γ-干扰素蛋白的一级结构和二级结构与人体内天然产生的γ-干扰素完全一致，表达的γ-干扰素完全水溶，不含内毒素。本专利技术中构建的生产用表达人γ-干扰素的毕赤酵母菌的菌种保藏号为CGMCCNO.0758，保存日期2002年07月03日，地址北京中关村中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，邮编100080。在设计人γ-干扰素基因时，将某些氨基酸的三联体密码子的第三个碱基加以更换，使其为甲醇酵母所喜欢的密码子。这样不会改变人γ-干扰素蛋白质的氨基酸顺序，但可提高γ-干扰素在甲醇酵母中的表达效率。Pichia pastoris的密码子偏爱性统计已经有相关的报道，根据这种密码偏爱性统计表对已知序列中存在的少量稀有密码进行点突变以实现基因的高表达，是一种行之有效的实现高表达的方法。但是当存在较多稀有密码而需要全合成基因时，仅仅采用偏爱密码将可能使合成基因出现G+C％失调、非期望的二级结构和氨酰tRNA拥挤等现象，最终结果可能反而得不到更高的表达量。在本专利技术中我们以剔除基因中的稀有密码子为主，按照以下方法来设计合成IFN-γ基因1.通过网上数据检索，从Http//www.kazusa.or.jp/codon处获得P.pastoris的密码子使用频率表。这个表共统计了P.pastoris中39个蛋白质的氨基酸密码子使用情况(表略)。2.将以上获得的P.pastoris密码子使用频率表适当修改后作为参数输入CODOP生物软件，并以人γ-干扰素氨基酸序列(图1)为基础，对天然人γ-干扰素基因序列进行重新设计。其中密码子有效数(Effective number ofcodons，Nc)的阀值设定为0.7，并以此值来判定稀有密码(注CODOP生物软件的主要功能是自动将稀有密码按比例随机替换成编码同一个氨基酸的非稀有密码)。3.采用Biosuite VectorNTI生物软件制作初步设计基因的限制性内切酶谱，并手工去除内部可能存在的Sac I、PshA I、Sal I、Bgl II、BamH I、Avr II、Xho I、Xba I酶切位点，以方便后续的基因操作。4.根据(G+C)％、基因内部的重复序列和是否存在mRNA拼接位点(图3)等，结合密码子使用表，进一步手工修改设计的基因序列。5.根据确定的PCR法全合成方案得出所需合成的24条引物序列(见图2)，通过基因序列的修改使所有引物的熔点都在50℃以上。6.在设计的基因序列两端根据需要加入适当的酶切位点以方便基因操作。7.对设计的γ-干扰素基因经计算机检查，排除不必要的二级结构，尤其要排除5’端的二级结构，以免影响mRNA的翻译功能。根据以上原则重新设计得到的IFN-γ基因(G+C)％为40.37；基因内部潜在的mRNA拼接模型和重复序列已经去除；密码子使用得到合理平衡；排除了影响mRNA的翻译功能的二级结构，尤其是排除了5’端的二级结构。所需合成24条引物(见图2)的熔点用计算都在52-60℃间，采用算法则都在60-70℃间。参考DNA混洗的方法，我们通过一步PCR装配和扩增最终得到了500bp左右的DNA片段(图4)。由于采用了pfu聚合酶反应，得到的DNA片段为平端产物，可以直接将获得的PCR产物装入经Sma I酶解的pUC18克隆载体中。X-Gal/IPTG蓝白斑筛选后，挑取一个克隆送交赛百胜公司测序，结果与理论设计的IFN-γ基因序列完全一致。对测序验证过的pUC18-ifn质粒经扩增、抽提后，用Avr II、EcoR I双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收pUC18-ifn基因片段，而后与同样用Avr II、EcoRI双酶切并经琼脂糖凝胶电泳回收的pPIC3.5K的载体相连接，用氨苄抗性筛选得到pPIC3.5K-ifn表达载体.此pPIC3.5K-ifn质粒DNA用Bgl II酶切线性化后琼脂糖凝胶电泳分离并回收其中含人γ-干扰素基因表达盒的片段，将此表达盒片段用于电击转化。同时用Bgl II酶切线性化的pPIC3.5K空质粒作为电击转化对照。电击转化及克隆筛选方法参照Invitrogen毕赤酵母实验手册，其中宿主细胞采用蛋白酶双缺菌株Pichia pastoris SMD1163(his4 pep4 prb1)。电击转化后的细胞涂布4块RDB平板，宿主细胞SMD1163为组氨酸缺陷，表达载体含编码组氨酸的基因，利用其互补效应筛选出组氨酸阳性克隆。各加2ml无菌蒸馏水至4块RDB平板中，洗出组氨酸阳性克隆并合并之，各吸取200μl菌体液分别涂布于含1、2、4、6mg/ml的G418 YPD平板上，挑选G418浓度4和6mg/ml两平板上的G418抗性多拷贝克隆。上述多拷贝克隆分别进行小量发酵表达，其方法如下用灭菌牙签挑取单克隆株，接种子含适量YPD的试管中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由基因工程菌发酵制备人γ－干扰素的方法其特征在于基因结构如下的人γ－干扰素基因序列，ＡＴＧ ＣＡＡ ＧＡＣ ＣＣＡ ＴＡＣ ＧＴＣ ＡＡＧ ＧＡＧ ＧＣＡ ＧＡＡ ＡＡＣ ＴＴＧ ＡＡＧ ＡＡＡ ＴＡＴ ＴＴＴ ＡＡＣ ＧＣＴ ＧＧ Ｔ ＣＡＴＭ Ｑ Ｄ Ｐ Ｙ Ｖ Ｋ Ｅ Ａ Ｅ Ｎ Ｌ Ｋ Ｋ Ｙ Ｆ Ｎ Ａ Ｇ ＨＴＣＴ ＧＡＣ ＧＴＧ ＧＣＡ ＧＡＣ ＡＡＴ ＧＧＡ ＡＣＡ ＴＴＡ ＴＴＴ ＴＴＧ ＧＧＴ ＡＴＴ ＴＴＧ ＡＡＧ ＡＡＣ ＴＧＧ ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＡＧＳ Ｄ Ｖ Ａ Ｄ Ｎ Ｇ Ｔ Ｌ Ｆ Ｌ Ｇ Ｉ Ｌ Ｋ Ｎ Ｗ Ｋ Ｅ ＥＴＣＡ ＧＡＴ ＡＧＡ ＡＡＧ ＡＴＴ ＡＴＧ ＣＡＡ ＴＣＣ ＣＡＧ ＡＴＣ ＧＴＣ ＴＣＣ ＴＴＣ ＴＡＣ ＴＴＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＴ Ｃ ＡＡＧ ＡＡＣＳ Ｄ Ｒ Ｋ Ｉ Ｍ Ｑ Ｓ Ｑ Ｉ Ｖ Ｓ Ｆ Ｙ Ｆ Ｋ Ｌ Ｆ Ｋ ＮＴＴＣ ＡＡＡ ＧＡＴ ＧＡＴ ＣＡＡ ＴＣＣ ＡＴＣ ＣＡＡ ＡＡＡ ＴＣＣ ＧＴＴ ＧＡＧ ＡＣＡ ＡＴＣ ＡＡＡ ＧＡＧ ＧＡＴ ＡＴＧ ＡＡＴ ＧＴＣＦ Ｋ Ｄ Ｄ Ｑ Ｓ Ｉ Ｑ Ｋ Ｓ Ｖ Ｅ Ｔ Ｉ Ｋ Ｅ Ｄ Ｍ Ｎ ＶＡＡＧ ＴＴＣ ＴＴＴ ＡＡＣ ＴＣＴ ＡＡＴ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＣＧＴ ＧＡＴ ＧＡＣ ＴＴＴ ＧＡＧ ＡＡＧ ＴＴＧ ＡＣ Ｃ ＡＡＴ ＴＡＣ ＴＣＡＫ Ｆ Ｆ Ｎ Ｓ Ｎ Ｋ Ｋ Ｋ Ｒ Ｄ Ｄ Ｆ Ｅ Ｋ Ｌ Ｔ Ｎ Ｙ ＳＧＴＴ ＡＣＡ ＧＡＣ ＴＴＧ ＡＡＴ ＧＴＣ ＣＡＡ ＣＧＴ ＡＡＧ ＧＣＡ ＡＴＣ ＣＡＣ ＧＡＧ ＣＴＧ ＡＴＴ ＣＡＡ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＣＡ ＧＡＡＶ Ｔ Ｄ Ｌ Ｎ Ｖ Ｑ Ｒ Ｋ Ａ Ｉ Ｈ Ｅ Ｌ Ｉ Ｑ Ｖ Ｍ Ａ ＥＣＴＴ ＴＣＴ ＣＣＡ ＧＣＴ ＧＣＴ ＡＡＡ ＡＣＣ ＧＧＡ ＡＡＧ ＡＧＡ ＡＡＧ ＡＧＧ ＴＣＴ ＣＡＡ ＡＴＧ ＴＴ Ｇ ＴＴＴ ＡＧＡ ＧＧＡ ＡＧＡＬ Ｓ Ｐ Ａ Ａ Ｋ Ｔ Ｇ Ｋ Ｒ Ｋ Ｒ Ａ Ｑ Ｍ Ｌ Ｆ Ｒ Ｇ ＲＣＧＴ ＧＣＴ ＴＣＴ ＣＡＡ ＴＡＧＲ Ａ Ｓ Ｑ Ｔｅｒｍ克隆插入带有甲醇调节型启动子（ＡＯＸ１）的载体ｐＰ ＩＣ３．５Ｋ中，获得表达载体ｐＰＩＣ３．５Ｋ－ｉｆｎ，采用蛋白酶缺陷的ＳＭＤ１１６３毕赤酵母菌为宿主，用Ｇ４１８抗性浓度递增法...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈国富，
申请(专利权)人：上海擎天生物制药技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]