重组的SARS病毒N蛋白羧基端肽段与GST的融合蛋白及方法技术

本发明专利技术公开了一种重组的ＳＡＲＳ病毒Ｎ蛋白羧基端肽段与ＧＳＴ的融合蛋白及方法。融合蛋白具有Ｓｅｑ．Ｎｏ．１的序列的多肽。其方法步骤为：１）ＰＣＲ扩增获得ＳＡＲＳ病毒Ｎ蛋白的Ｃ端片段克隆；２）转化酵母宿主细胞；３）诱导转化后的酵母细胞进行蛋白质表达；４）回收纯化与ＧＳＴ融合的重组蛋白。该融合蛋白与非典病人的血清呈阳性反应，而与正常人血清呈阴性反应。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及人类医学卫生领域，尤其涉及一种重组的SARS病毒N蛋白羧基端肽段与GST的融合蛋白及方法。
技术介绍
2002年底在世界各地爆发了一种急性呼吸道传染病，世界卫生组织(WTO)称其为重症急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)，中文俗称“非典型性肺炎”，简称非典。该病起病急、传播快，病死率高达5-10％。目前涉及到世界近30个国家和地区，全球患者已达8000多例，并造成多人死亡，发病人数仍有不断增加的趋势。2003年4月16日，世界卫生组织宣布，经过全球10个国家和地区13个实验室的通力合作，确认在全球多个国家快速传染的非典型肺炎(英文名称为SARS，下文简称“非典”)的病原体是一种冠状病毒，以前从未在人体中发现过。非典型肺炎病原，即SARS病毒的分离和确证，对于该病的临床诊断、治疗及预防至关重要，这也是本专利技术所要解决的问题。为筛选具有抗原性的冠状病毒特异的蛋白或多肽片断，我们用“非典”病人血清筛选了病毒蛋白的多肽库，发现有些片段呈明显的阳性反应，其中冠状病毒N蛋白(nucleocapsid protein)的羧基端，简称C末端，集中了二个阳性较强的肽段。为进一步调查该片段的抗原性，我们克隆了覆盖该片段的编码序列，并用酵母表达系统进行了体外表达，获得了融合蛋白。用来自病人的血清作Western检测，发现该融合蛋白呈阳性反应，进一步用ELISA检测，融合蛋白与正常人血清呈阴性反应，而与“非典”病人血清呈阳性反应。表明该蛋白可以作为检测SARS病毒的抗原蛋白，用于SARS病人的检测，也可以是作为抗SARS病毒的疫苗的候选蛋白。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种重组的SARS病毒N蛋白羧基端肽段与GST的融合蛋白及方法。重组的SARS病毒N蛋白羧基端肽段与GST的融合蛋白具有Seq.No.1的序列的多肽。其方法具体步骤为 1)PCR扩增获得SARS病毒N蛋白的C端片段克隆；2)转化酵母宿主细胞；3)诱导转化后的酵母细胞进行蛋白质表达；4)回收纯化与GST融合的重组蛋白。本专利技术的优点是通过基因重组的方法，利用酵母细胞表达了SARS病毒N蛋白C端的融合蛋白，该融合蛋白能与非典病人的血清呈阳性反应，而与正常人血清呈阴性反应。这表明该融合蛋白可作为SARS病毒检测的抗原体，并能作为疫苗的候选蛋白，同时，我们还建立了表达纯化该融合蛋白的实验体系。附图说明图1是PCR扩增冠状病毒N蛋白的C末端编码区示意图，图中，箭头所示为500bp大小的扩增产物；图2是用EcoRI酶切鉴别重组克隆示意图，图中，pEGH为没有重组的质粒，pEGH-NC为含有SARS病毒N蛋白C端的重组质粒；图3是用Anti-Histag抗体检测重组蛋白的表达示意图；图4是用GST树脂纯化重组蛋白示意图；图5是用SARS病人血清检测重组蛋白的抗原性示意图，图中，A，B分别为两个病人的检测结果，箭头所示为重组的融合蛋白；图6是用ELISA检测不同的抗血清与重组蛋白的反应示意图，图中，1、2、3、4位确诊SARS病人的检测结果，5、6、7、8位正常人对照。具体实施例方式一、PCR扩增获得SARS病毒N蛋白的C端片段克隆提取病毒RNA，以此为模板反转录合成为cDNA后，通过PCR扩增获得含N蛋白C端编码区的产物，克隆到pGEM-T载体(Promega公司)中。以含该片段的质粒DNA为模板，利用含酵母表达载体序列的一对引物将目标片段再次用PCR扩增，获得的产物用1％的琼脂糖电泳检测，所获得的片段符合预计的长度。A.扩增N蛋白C末端所用的引物序列5’-AAAGGACAAAAAGAAAAAGACTG -3’5’- AATTTTACACATTAGGGCTCTTC-3’B.含酵母表达载体序列的引物5′-GGCAGATCGTCAGTCAGTCACGATGAAAATTTTACACATTAGGGCTCTTC-3′5′-GCATCACCATCACCATCACGGTGGTGGTAAGGACAAAAAGAAAAAGACTG-3′C.扩增的片段序列如
技术实现思路
的Seq.No.1所述的多肽片断。二、转化酵母宿主细胞1.表达载体DNA的线性化本实验所用的酵母表达载体为pEGH(参见Zhu Heng等，Naturegenetics，2000)，将pEGH质粒DNA用HindIII和XbaI酶切后备用。2.转化酵母细胞混合线性化的pEGH质粒DNA和PCR产物，用PEG法转化酵母细胞，转化后的酵母细胞涂于SC-Ura-固体平板培养基，30度培养2天后，肉眼可见再生菌落。酵母培养基SC-Ura-固体培养基、SC-Ura-/葡萄糖液体培养基、SC-Ura-/棉子糖液体培养基配制按《酵母遗传实验方法》(清华大学出版社2002年第一版)3.重组菌落的鉴别用苯酚法提取酵母的质粒DNA后，用电激法转化大肠杆菌感受态细胞，挑取再生菌落接种到LB液体培养基(含Ampicillin 60ug/ml)，37度培养过夜后，提取质粒DNA，用EcoRI限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳鉴别重组克隆，含有目标片段的质粒DNA产生的一条片段大于对照质粒DNA，见图2。对目标菌落测序，证明所获得的重组克隆含有来源于SARS病毒的N蛋白C末端。4.将目标克隆转化酵母细胞将测序确认后的质粒DNA用PEG法转化酵母细胞，转化后的酵母细胞涂于SC-Ura-固体平板培养基，30度培养2-3天后获得再生菌落。三、融合蛋白的诱导表达与检测接种再生菌落到5ml SC-Ura/葡萄糖液体培养基中，30度振荡培养过夜，取0.2ml过夜菌接种到50ml SC-Ura-/棉子糖培养基中，至OD600＝0.6-0.8后加入D-半乳糖(终浓度为2％)继续振荡培养4-5小时。离心收集培养物，无菌水洗2次。四、回收纯化与GST融合的重组蛋白用裂解液重新悬浮酵母细胞，加入酸洗过的玻璃珠(Sigma，G-8772)，剧烈振荡3-5分钟，离心后回收上清，再加入裂解液悬浮，振荡，回收上清，合并两次上清，高速离心去掉不溶物，将上清转移到另一离心管中，加入GST树脂(Glutathione-uniflow resin，购自Clontech公司)，旋转混合1小时，离心回收GST树脂，用裂解液洗3次，再加入还原型谷胱苷肽(20mM)，旋转混合1小时，离心回收上清，即为纯化的重组蛋白，将获得的融合蛋白用SDS-PAGE分离后，考马斯亮兰染色，脱色后可见纯化的蛋白条带，考染的结果表明，获得的蛋白纯度较高，没有可见的杂蛋白污染，见图4。五、Western检测融合蛋白本实验所用的酵母表达载体产生的是“GST-His-目标蛋白”的融合产物，为了检测表达产物，将酵母的细胞裂解液加入点样缓冲液，100度加热5分钟，用10％的SDS-PAGE分离，然后将蛋白样品转到PVDF膜上，用脱脂牛奶封闭1小时，“一抗”用anti-His tag抗体保温2小时，漂洗后加入“二抗”(anti-rabbitIgG，购自北京中山公司)，保温1小时后，用一步法检测试剂盒检测。实验结果如图3所示。表达目标蛋白的泳道的条带显然大于对照泳道中表达GST的条带，表明该系统产生了融合蛋白，从条带的大小及测序结果可以认定，该融合蛋白中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组的ＳＡＲＳ病毒Ｎ蛋白羧基端（Ｃ端）肽段与ＧＳＴ的融合蛋白，其特征在于具有Ｓｅｑ．Ｎｏ．１的序列的多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘国振，胡少晖，胡咏武，陈鹏，殷剑宁，方健秋，文洁，朱衡，刘斯奇，于军，汪建，杨焕明，
申请(专利权)人：杭州华大基因研发中心，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]