制备2-脱氧核糖5-磷酸的方法技术

本发明专利技术披露了在微生物本身或衍生自所述微生物的酶存在下，反应甘油醛３－磷酸和乙醛来制备２－脱氧核糖５－磷酸的方法；所述微生物包含２－脱氧核糖５－磷酸醛缩酶但基本上不含磷酸酶。本发明专利技术也披露了在微生物本身或衍生自所述微生物的酶存在下，反应二羟丙酮磷酸和乙醛来制备２－脱氧核糖５－磷酸的方法；所述微生物包含２－脱氧核糖５－磷酸醛缩酶和丙糖磷酸异构酶，但基本上不含磷酸酶。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及使用微生物本身或者衍生自所述微生物的酶以高产率稳定地。本专利技术也涉及能产生酶的微生物，所述酶可以用于制备2-脱氧核糖5-磷酸。在脱氧核苷的生化合成中使用2-脱氧核糖5-磷酸作为原料。而且，通过去磷酸化2-脱氧核糖5-磷酸可以获得2-脱氧核糖。在核苷的化学合成中使用2-脱氧核糖作为原料。
技术介绍
通常，2-脱氧核糖5-磷酸用酶水解DNA或化学磷酸化2-脱氧核糖来制备。但是，前一方法存在如下的问题DNA作为原料很昂贵，且需要大量的分离/纯化工艺。后一方法也存在如下的问题区域选择磷酸化2-脱氧核糖很难。因此，2-脱氧核糖5-磷酸不能通过上述两种方法廉价地制备。在体内，已知2-脱氧核糖5-磷酸通过2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶(脱氧核糖磷酸醛缩酶EC4.1.2.4)的催化作用，由甘油醛3-磷酸和乙醛产生。但是，上述反应中2-脱氧核糖5-磷酸的制备存在如下问题甘油醛3-磷酸作为底物的化学合成并不容易，且作为另一底物的甘油醛不稳定，易于异构形成更加稳定的异构体二羟丙酮。还已知由于通过丙糖磷酸异构酶(EC5.3.1.1)异构化二羟丙酮磷酸的异构化反应，在体内产生甘油醛3-磷酸。作为上述反应底物的二羟丙酮磷酸可以化学或者生化合成(例如，参考Itoh，N.Tsujibata，Y.，Liu，J.Q.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，第51卷，193-200页，1999)。但是，上述报告的目标是对戊糖体内代谢和醛缩酶立体特异作用的学术分析，且甘油醛3-磷酸和2-脱氧核糖5-磷酸的工业生产绝对超出报告的范围。至今，并没有报道工业生产2-脱氧核糖5-磷酸的方法。关于使用酶或者酶试剂来，在以下学术文献中报道了若干例子。其中，就有以下的报道通过2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶的作用由甘油醛3-磷酸和乙醛作为底物制备2-脱氧核糖5-磷酸(Barbas，III，C.F.，Wang，Y.，Wong，C.，J.Am.Chem.Soc.，第112卷，第2013-2014页，1990)。但是，在这一报告中并不能获知2-脱氧核糖5-磷酸就作为原料的底物量而言的产率，因为所述报告没有揭示产生2-脱氧核糖5-磷酸的量。而且在另一实例中，有以下的报道使用作为生化试剂的市售丙糖磷酸异构酶和通过大肠杆菌制备的2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶的粗制酶，由二羟丙酮磷酸和乙醛作为底物制得2-脱氧核糖5-磷酸，所述粗制酶已经在EDTA作为磷酸酶抑制剂和氮气存在下，用具有2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶基因(deo C基因)的质粒转化(Chen，L，Dumas，D.P.，Wong，C.，J.Am.Chem.Soc.，第114卷，第741-748页，1992)。但是，在这些学术报告中，所述酶衍生自不同的来源，在试剂等级下进行纯化。此外，虽然使用显著量的EDTA来抑制磷酸酶的去磷酸化作用，但是并不能完全消除磷酸酶的影响。因此，所述方法并不适合2-脱氧核糖5-磷酸的工业生产。在糖代谢如糖酵解途径和戊糖磷酸循环中，甘油醛3-磷酸是重要的中间体(例如，参考《生物化学词典》第三版，1998，Tokyo Kagaku，Dojin，第411页，)。因此，甘油醛3-磷酸通过细胞中的各种酶向各种途径进行代谢。而且，存在以下的问题甘油醛3-磷酸的磷酸基容易被磷酸酶切去。专利技术披露考虑到上述的问题，本专利技术的目的是提供以高产率稳定地。本专利技术的第一目的是发现有显著量酶的微生物，所述微生物涉及2-脱氧核糖5-磷酸的合成，但是仅含有极少量不需要的糖酵解酶如磷酸酶，使得可以使用作为底物的甘油醛3-磷酸和乙醛，或者作为底物的二羟丙酮磷酸和乙醛以高产率制得2-脱氧核糖5-磷酸。为了达到上述目的，本专利技术的专利技术人分三步寻找所述微生物，从大量和多种菌株中完成上述的条件。因此，本专利技术人发现了由作为底物的甘油醛3-磷酸和乙醛、或者二羟丙酮磷酸和乙醛以高产率产生2-脱氧核糖5-磷酸的微生物，由此完成本专利技术。本专利技术概述如下(1)，所述方法包括在微生物本身或衍生自所述微生物的酶存在下，反应甘油醛3-磷酸和乙醛，所述微生物包含2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶，但基本上不含磷酸酶。(2)，所述方法包括在微生物本身或衍生自所述微生物的酶存在下，反应二羟丙酮磷酸和乙醛，所述微生物包含2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶和丙糖磷酸异构酶，但基本上不含磷酸酶。(3)根据上面(1)所述，其中，所述微生物是属于肠杆菌科的微生物。(4)根据上面(2)所述，其中，所述微生物是属于肠杆菌科的微生物。(5)，所述方法包括在微生物本身或衍生自所述微生物的酶存在下，反应甘油醛3-磷酸和乙醛，所述微生物属于克雷伯氏菌属，且包含2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶。(6)，所述方法包括在微生物本身或衍生自所述微生物的酶存在下，反应二羟丙酮磷酸和乙醛，所述微生物属于克雷伯氏菌属，且包含2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶和丙糖磷酸异构酶。(7)根据上面(1)、(3)和(5)任一项所述，其中，所述微生物是肺炎克雷伯氏菌B-44(IFO 16579)。(8)根据上面(2)、(4)和(6)任一项所述，其中，所述微生物是肺炎克雷伯氏菌B-44(IFO 16579)。(9)肺炎克雷伯氏菌B-44(IFO 16579)能产生2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶和丙糖磷酸异构酶，但基本上不含磷酸酶。附图简要说明附图说明图1是显示培养时间对2-脱氧核糖5-磷酸产生的影响的图。图2是显示反应溶液pH对2-脱氧核糖5-磷酸产生的影响的图。图3是显示Tris-盐酸缓冲溶液(pH9.0)浓度对2-脱氧核糖5-磷酸产生的影响的图。图4是显示反应溶液中微生物细胞浓度对2-脱氧核糖5-磷酸产生的影响的图。图5是显示反应溶液中乙醛浓度对2-脱氧核糖5-磷酸产生的影响的图。图6是显示反应溶液中底物浓度对2-脱氧核糖5-磷酸产生的影响的图，其中，各情况分别使用甘油醛3-磷酸和二羟丙酮磷酸作为底物。图7是显示反应溶液温度对2-脱氧核糖5-磷酸产生的影响的图。图8是显示在最佳条件下随时间推移，由甘油醛3-磷酸产生的2-脱氧核糖5-磷酸量的改变的图。图9是显示在最佳条件下随时间推移，由二羟丙酮磷酸产生的2-脱氧核糖5-磷酸量的改变的图。实施本专利技术的最佳方式以下将详细说明本专利技术。{通过酶反应合成2-脱氧核糖5-磷酸}在本专利技术方法中，如以下反应式(1)所示，通过包含2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶的微生物本身的催化作用或者衍生自所述微生物的酶的催化作用，由作为原料的甘油醛3-磷酸和乙醛产生2-脱氧核糖5-磷酸。下文中，2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶也称为“DERA”。通式(1)的反应是平衡反应，但是所述平衡偏向于2-脱氧核糖5-磷酸的生产方面。通式(1) 甘油酯3-磷酸乙醛 2-脱氧核糖5-磷酸本专利技术中，如以下通式(2)所示，通过包含丙糖磷酸异构酶的微生物本身的催化作用或者衍生自所述微生物的酶的催化作用，异构化二羟丙酮磷酸来产生甘油醛3-磷酸。下文中，丙糖磷酸异构酶还称为“TPI”。通式(2) 二羟丙酮磷酸 甘油醛3-磷酸当微生物包含丙糖磷酸异构酶和2-脱氧核糖5-磷酸醛缩酶时，由于所述微生物本身或者衍生自所述微生物的酶的催化作用，通式(2)的异构化反应和通式(1)的醛缩酶反应顺序地发生。因此，在本专利技术中，可以由作为原料本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备２－脱氧核糖５－磷酸的方法，其特征在于，所述方法包括：在微生物本身或衍生自所述微生物的酶存在下，反应甘油醛３－磷酸和乙醛；所述微生物包含２－脱氧核糖５－磷酸醛缩酶，但基本上不含磷酸酶。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：清水昌，小川顺，
申请(专利权)人：有机合成药品工业株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]