用于含杂合同种型抗体部分的蛋白质的表达技术制造技术

本发明专利技术公开了用于有效表达抗体融合蛋白质的方法和组合物。本发明专利技术的抗体融合蛋白质包括一杂合抗体部分，所述杂合抗体部分含有来自一种以上抗体的序列和／或突变体抗体序列。本发明专利技术的杂合抗体融合蛋白质可以高水平产生，且除了非抗体部分的功能活性外还可以将不同抗体类型的特征性功能活性组合在一起。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术一般涉及这样的方法和组合物，其用于带有源自两种或多种同种型的部分的抗体及来自此抗体的融合蛋白质，包括含有具有改变的效应子功能、增强的蛋白质表达和/或降低的寡聚化的抗体部分的蛋白质。本专利技术特别涉及这样的抗体和融合蛋白质，其中铰链区源自一种同种型而CH2结构域源自不同的同种型。
技术介绍
从遗传改造细胞中表达蛋白质的效率是一重要的商业问题。一些商业上重要的蛋白质最好从真核细胞中产生以保证正确的折叠和糖基化，所述真核细胞如哺乳动物细胞、植物细胞或酵母细胞。但是，维持大规模真核细胞培养的费用意味着用此方法生产的蛋白质是昂贵的。因此，在本领域内需要对真核细胞内蛋白质的表达水平实现最大化。一相关的问题是产生于真核细胞的治疗性蛋白质必须以正确的构象形态进行表达。通常，转录和翻译的机制确保了遗传改造细胞产生的蛋白质的序列由编码该蛋白质的核苷酸决定。但是，转录及翻译过后，蛋白质可能没有正确折叠且可能被降解。备选地，蛋白质可以以聚集状态产生，结果降低了活性。即使聚集的蛋白质具有活性，由于与非聚集蛋白质相比其免疫原性增加而不能被药理学接受。这样，药理学可接受的蛋白质制品一般应基本不含有聚集的蛋白质。从遗传改造的真核细胞中表达的蛋白质的数量取决于编码基因的转录速率、mRNA剪切及移出细胞核的效率及翻译效率。这些事件在蛋白质表达中起到的作用已被充分理解，遗传工程和蛋白质表达领域内的技术人员通常可将合适的核酸序列加入到表达构建体的设计中，以实现高效的转录、剪切、mRNA移出和翻译。但是，产生于真核细胞的正确折叠的非聚集蛋白质的数量也取决于蛋白质的氨基酸序列以及决定转录、剪切、mRNA移出、翻译和翻译后修饰的核酸序列。例如，细胞内合成的相当大一部分蛋白质被认为会发生降解。蛋白质中决定是否应被降解的特征目前正是一个深入研究的主题，但当前还不可能仅通过检查蛋白质的序列来预测蛋白质折叠、降解或聚集的效率。一些天然存在的蛋白质以高效率折叠、抵抗蛋白质水解且不发生聚集。相反，其他的蛋白质折叠效率低、迅速被降解且发生聚集。抗体和含抗体一部分的人工蛋白质，此处命名为抗体融合蛋白质或Ig融合蛋白质，对于许多涉及抗体可变区的靶向能力以及恒定区结合多种其他蛋白质的能力的目的是有用的。抗体和抗体融合蛋白质制备物当它们正确折叠且非聚集时是非常有用的。因此，本领域内需要能用于生产聚集减少的抗体和抗体融合蛋白质制备物的方法和组合物。此外，由于抗体和抗体融合蛋白质能结合多种其他蛋白质而导致，例如，引起特异的效应子功能，故所述抗体和抗体融合蛋白质是有用的。在一些情况中可能需要特异效应子功能，但经常的情况是优选使效应子功能丧失。通过利用修饰抗体，融合蛋白质的抗体成分可经过改变而减小或消除效应子功能。当抗体和抗体融合蛋白质制备物经过修饰而改变了功能性时也是有用的。因此，本领域内存在对如下方法和组合物的需要，所述方法和组合物可用于生产具有改变的效应子功能的修饰抗体和抗体融合蛋白质。蛋白质药物可被蛋白酶降解，因此它们的递送和药物动力学特性并非最佳。本领域内存在对改进的蛋白质药物的需要，所述改进的蛋白质药物具有某些蛋白质的有用特性，但具有更大的蛋白酶抵抗力。专利技术概述本专利技术着重描述用于生产完整抗体、免疫细胞因子、免疫融合体、免疫配体和其他抗体和Fc融合蛋白质的方法和组合物，其可以促进所需融合蛋白质的表达、正确寡聚化、纯化和蛋白酶抗性，其中所述所需融合蛋白质任选地具有修饰的、组合的或减弱的Fc效应子功能。特别是，本专利技术提供具有杂合同种型的抗体部分，及任选地突变Ig成分在完整的抗体中以及在含抗体部分的融合蛋白质中的应用。IgG/IgG杂合同种型在一组优选的实施方案中，本专利技术提供了具有减弱的效应子功能和增强的组装功能的融合蛋白质。在使用Ig部分增强表达和提高血清半衰期，而又不需要此Ig部分的免疫学功能时，此类融合蛋白质特别有用。在这些实施方案中，融合蛋白质优选地包含IgG2或IgG4的CH1、CH2和/或CH3结构域，以及来自IgG1的铰链区或来自IgG4的铰链区，后一铰链区优选包含可在重链来源的部分间促进二硫键正确形成的突变(Angal S，等.分子免疫学(Mol Immunol)1993年，一月；30(1)105-8)。该实施方案的融合蛋白质将有利于完整抗体和含Fc区域的Ig融合蛋白质的高水平表达及提高其正确组装。在一更为优选的实施方案中，融合蛋白质在Ig部分内还含有一个或多个突变。例如，Ig部分可以经过突变而进一步减少不需要的任何残留的效应子功能。例如，可以对IgG2的CH2结构域内的C1q结合位点实施突变。例如正常的IgG4由于在相应IgG1的331位的脯氨酸处含有丝氨酸而不能够结合补体(Eu命名法)(Tao，MA等(1993)J.Exp.Med.178661-667；Brekke，OH等(1994)Eur.J.Immunol.242542-2547)；在IgG2中的一个类似突变减弱了C1q结合。也可以对其他已知参与C1q结合的残基进行修饰，例如对318、320、322和297位的残基进行修饰(Duncan AR(1988)自然(Nature)332738-740)，导致C1q结合的减弱。在另外一组优选的实施方案中，铰链区也存在突变。例如，在抗体轻链也存在的情况下，优选的IgG1铰链区的形式为在其正常位置存在有正常数目的半胱氨酸残基。但是，在抗体轻链不作为一条独立多肽链存在时，优选IgG1铰链的第一个半胱氨酸被突变为另一个残基。例如，在Fc-X蛋白质、X-Fc蛋白质和单链抗体中应用此突变的铰链区是有利的，其中所述单链抗体中轻链可变区通过多肽接头连接重链。在此情形下，IgG1铰链中的第一半胱氨酸优选地突变为丝氨酸。在涉及突变铰链区的第二类实施方案中，应用突变形式的IgG4铰链以允许在两重链间有效形成二硫键。在涉及突变铰链区的第三类实施方案中，在杂合同种型抗体或Ig融合蛋白质中使用突变形式的IgG2铰链(其中头两个半胱氨酸每一个均突变为另一氨基酸)。也可方便地将此突变铰链用于完全来自IgG2的抗体或Ig融合蛋白质中。例如，可将具有ERKSSVECPPCP(SEQ ID NO1)序列的修饰IgG2铰链用于抗体或Ig融合蛋白质中。另一有用的铰链类型为IgG2铰链和IgG4铰链的杂合体，例如序列ESKYG-VECPPCP(SEQ IDNO2)，其中破折号前的5个氨基酸来自IgG4而剩余的氨基酸来自IgG2。这些实施方案在抗体和Ig融合蛋白质从真核细胞表达和分泌的情形下特别有用，因为这些铰链实施方案可以促进蛋白质的正确折叠。这些实施方案可用作IgG1铰链的备选。这些抗体铰链实施方案的一个关键特征是它们仅含有两个半胱氨酸残基。再一类实施方案涉及杂合同种型Ig融合蛋白质的Ig部分内的突变，突变位于Ig和非Ig部分的连接处。在一个实施方案中，融合蛋白质氨基酸序列内的改变优选地位于Ig部分和非Ig部分的连接处，且优选地位于连接点的10个氨基酸内。更优选地，氨基酸的改变涉及抗体部分C末端的赖氨酸变为疏水氨基酸，如丙氨酸或亮氨酸。一备选实施方案用于需要缩短融合蛋白质的半衰期的情形中。IgG3由于位于CH3结构域内的FcRn/FcRp结合位点内发生修饰(H435变为R)而本文档来自技高网...

【技术保护点】
融合蛋白质，其包含与非免疫球蛋白部分融合的免疫球蛋白部分，其中所述免疫球蛋白部分包含来自第一抗体同种型的第一结构域和来自第二抗体同种型的第二结构域。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：SD吉利斯，J韦，劳健明，
申请(专利权)人：默克专利有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]