新型抗肿瘤人参皂苷的制备方法技术

本发明专利技术涉及酶解或微生物发酵水解人参皂苷制备３位羟基游离的低极性人参皂苷：２０－Ｏ－β－Ｄ－木糖（１→６）－β－Ｄ－葡萄糖－２０（ｓ）－原人参二醇［２０－Ｏ－β－Ｄ－ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ（１→６）－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－２０（Ｓ）－ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ，简称Ｍｘ］、２０－Ｏ－α－Ｌ－阿拉伯糖（１→６）－β－Ｄ－葡萄糖－２０（Ｓ）－原人参二醇［２０－Ｏ－α－Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ（１→６）－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ２０（Ｓ）－ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ，简称Ｃ－Ｙ］和２０－Ｏ－α－Ｌ－阿拉伯糖（１→６）－β－Ｄ－葡萄糖－２０（Ｓ）－原人参二醇［２０－Ｏ－α－Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ（１→６）－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ２０（Ｓ）－ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ，简称Ｍｃ］的方法，特别是涉及粗蜗牛酶水解制备方法。本发明专利技术中所用蜗牛酶酶活性高、选择性好、离子强度要求低、抗失活能力强、来源方便、价格低廉，用该酶制备Ｍｘ、Ｃ－Ｙ或Ｍｃ工艺简单方便、成本低、回收率高，产品质量好，可以满足医药、化妆及功能食品领域的需求，应用和开发价值极大。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及酶解或微生物发酵水解人参皂苷制备3位羟基游离的低极性人参皂苷20-O-β-D-木糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(s)-原人参二醇、20-O-c-L-阿拉伯糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(S)-原人参二醇和20-O-α-L-阿拉伯糖(1→6)-β-D-葡萄糖-20(S)-原人参二醇[20-O-a-L-arabinofuranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl 20(S)-protopanaxadiol，简称McJ的方法，特别是涉及粗蜗牛酶水解制备方法。
技术介绍
人参皂苷具有多种药效功能，如抗肿瘤和免疫调节、改善微循环、调节消化机能、安神、抗衰老、抗紧张、预防消化道溃疡、提高生命质量、增强记忆力和学习能力等。但天然人参皂苷几乎不能被肠道直接吸收入血，并且，药代动力学行为较差。近来，先后发现多种由天然人参皂苷经生物转化而来的代谢产物3位羟基游离的低极性人参皂苷，如C-K、C-Y和Mc。它们分别被证明是相应天然人参皂苷的口服吸收形式。Hasegawa等研究发现C-K在抗肿瘤方面具有诱导肿瘤细胞分化、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长、抑制肿瘤诱导的新生血管形成、抗击肿瘤的浸润和转移等多种生物活性；另外，C-K具有良好的药代动力学行为且基本无毒或毒性很低，目前，在韩国已进入III期临床研究。源于天然人参皂苷Rb2和Rc的代谢产物C-Y和Mc具有与C-K相似的药效活性。由于天然人参或天然人参皂苷口服后L乎不直接吸收，口服后上述三种可吸收的代谢产物是通过人体肠道菌的转化而来。因机体的人参皂苷肠道菌代谢能力存在个体差异，因此，理论上，直接使用转化物可以避免吸收障碍，使临床上易于掌握有效剂量。人参皂苷20位的糖苷键在酸性介质中的稳定性低于3位糖苷键，并且空间阻碍作用使酶水解20位的糖苷键活力极低。因而，生物转化无疑是制备3位羟基游离的低极性人参皂苷的最佳方法。生物转化包括酶法和微生物发酵法。Hasegawa将天然人参皂苷与肠道菌一起体外厌氧培养，从培养液中分离得到C-K、C-Y和Mc，并申请了美国专利(5,919,770)。由于厌氧培养时，3位羟基游离的低极性人参皂苷不是唯一产物、并且原料转化率低、分离纯化繁琐、培养条件苛刻、成本居高。因而，酶法更受关注。目前，文献中提供的酶法有柚皮苷酶和橙皮苷酶，但该酶有下列缺陷水解时间长、酶的用量大，酶的来源不易，因此，不适于工业制备。我们先前的研究专利技术了在工艺及成本上均有优势的C-K的酶法制备方法(中国专利，申请号01133410.X)和微生物发酵方法(中国专利，申请号02132403.4)。两项技术专利技术较之肠道菌和柚皮苷酶、橙皮苷酶的制备技术有多种优势。同时利用上述技术，以三七茎叶中富含的人参皂苷Rb3为原料，本专利技术的专利技术人发现了Mx这一具有抗肿瘤活性的新化合物，Mx具有与C-K相似的生物活性，而较之人参，三七及其茎叶在我国具有更加明显的资源优势，其结构式如下 专利技术的
技术实现思路
为了简单、方便、低成本、大批量地制备Mx、C-Y和Mc，本专利技术提供了一种用酶解或微生物发酵水解人参皂苷制备人参皂苷制备Mx、C-Y或Mc的方法，包括水解、收集和酶回收利用步骤，其特征在于用糖苷酶在缓冲液中分别选择性水解人参皂苷Rb3或三七叶苷、Rb2、Rc，皂苷与糖苷酶的重量比为1∶1～10∶1，温度为30～45℃，pH 3.0～5.5，水解时间2～72小时。本专利技术所提供酶水解人参皂苷制备Mx、C-Y或Mc的方法中，要求糖苷酶对糖苷键的水解具有良好的选择性，即仅水解3位糖苷键而不影响20位的木糖基和葡萄糖基。糖苷酶可来源商品酶如蜗牛酶、橙皮苷酶、柚皮苷酶等，也可自自然界中筛选分离具有选择性糖苷酶活性的微生物，如螺旋菌属、弯曲菌属、柔曲杆菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属、叶状菌属、甲基球菌属、奈氏菌属、黄杆菌属、类杆菌属、放线杆菌属、鲍特氏菌属、副球菌属、肠杆菌属、变形杆菌属、发光杆菌属、纤毛菌属、琥铂酸弧菌属、月形单胞菌、微球菌属、口腔菌属、肠球菌属、乳酸链球菌、厌氧链球菌、明串珠球菌属、片球菌属、消化球菌属、粪球菌属、芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属、梭菌属、乳杆菌属、李斯特氏菌属、棒状杆菌属、节杆菌属、短杆菌属、干酪杆菌属、微杆菌属、纤维杆菌属、优杆菌属、放线菌属、分枝杆菌属、奴卡氏菌属、糖化多孢子菌属、前微小单孢子菌属、念珠菌属、青霉菌、曲霉菌属、毛霉菌属、隐球菌属、假丝酵母菌等，也可用上述微生物具有选择性糖苷酶活性的生物制品。本专利技术所提供酶水解人参皂苷制备Mx、C-Y或Mc的方法中，酶法工艺的简便、产品分离和纯化容易，优于微生物发酵水解。本专利技术所提供酶水解人参皂苷制备Mx、C-Y或Mc的方法中，制备Mx、C-Y和Mc的原料分别为人参皂苷Rb3、Rb2、Rc，或含有Rb3、Rb2、Rc的植物、植物提取物或植物培养液。本专利技术所提供酶水解人参皂苷制备Mx、C-Y或Mc的方法中，蜗牛酶水解原料人参皂苷的酶活性高、选择性好、抗失活能力强、来源方便、价格低廉，特别适用于Mx、C-Y和Mc的生产制备。粗蜗牛酶水解原料人参皂苷的最适温度为40℃，最适pH为4.5，离子强度越低越好，缓冲液的种类对酶活性影响不大；本专利技术选用pH4.5，离子强度为0.001mol·L-1，的磷酸-柠檬酸缓冲液；原料与酶的比例以6∶1最为经济；依照此条件，水解时间超过8小时后，Mx的产量不再发生变化，因此，水解时间以8小时为宜。本专利技术所提供酶水解人参皂苷制备Mx、C-Y或Mc的方法中，酶反应液在除沉淀物和小分子杂质后，可循环使用。本专利技术所提供酶水解人参皂苷制备Mx、C-Y或Mc的方法中，筛选分离具有选择性糖苷酶活性的微生物时，采用酶诱导法与抗生素抗性诱导法，以增加微生物糖苷酶的含量或增强微生物水解能力，同时加入的抗生素，还可以防止杂菌污染。本专利技术所提供酶水解人参皂苷制备Mx、C-Y或Mc的方法中，收集过程是(1)酶法收集酶反应沉淀物，制成悬浊液；乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯液，减压回收乙酸乙酯后，收集的残余物即为Mx、C-Y或Mc；若原料为含有Rb3、Rb2和Rc的植物、植物提取物或植物培养液，所获粗产物还需经吸附树脂纯化。(2)微生物发酵法用水饱和的正丁醇提取培养基三次，合并正丁醇提取液，活性炭去色除臭，减压浓缩回收正丁醇，残余物溶于乙酸乙酯并用硅胶柱层析和反相层析纯化后获Mx、C-Y或Mc。本专利技术所提供酶水解人参皂苷制备Mx、C-Y或Mc的方法中，加入一定量的有机溶剂对中间产物起助溶作用，有利于酶水解反应的正常进行。有机溶剂的种类和加入量以不影响酶活性为准。经筛选，以5～15％的乙醇最佳。本专利技术为人参二醇皂苷酶解制备人参皂苷Mx、C-Y或Mc提供了一种来源方便、价格低廉的酶，用该酶制备Mx、C-Y和Mc工艺简单方便、成本低、回收率高。使用本方法制备的Mx、C-Y和Mc含量≥95％，苷元收率≥91％。具体实施例方式实施例1人参皂苷Rb3(500mg)与蜗牛酶(84mg)酶溶于32mL磷酸-柠檬酸缓冲液(pH4.5，离子强度为0.001mol·L-1，含10％的乙醇)中，40℃水浴中水解1天；离心反应液、收集沉淀，用水将沉淀物制成悬浊液，乙酸乙酯萃取(10mL×5)悬浊液，合并乙酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用酶水解人参二醇型皂苷制备３位羟基游离的低极性人参皂苷：２０－Ｏ－β－Ｄ－木糖（１→６）－β－Ｄ－葡萄糖－２０（ｓ）－原人参二醇［２０－Ｏ－β－Ｄ－ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ（１→６）－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－２０（Ｓ）－ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ，简称Ｍｘ］、２０－Ｏ－α－Ｌ－阿拉伯糖（１→６）－＊－Ｄ－葡萄糖－２０（Ｓ）－原人参二醇［２０－Ｏ－α－Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ（１→６）－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ２０（Ｓ）－ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ，简称Ｃ－Ｙ］或２０－Ｏ－α－Ｌ－阿拉伯糖（１→６）－β－Ｄ－葡萄糖－２０（Ｓ）－原人参二醇［２０－Ｏ－α－Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ（１→６）－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ２０（Ｓ）－ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ，简称Ｍｃ］的方法，包括水解、产物收集和酶回收利用步骤，其特征在于：用糖苷酶在缓冲液中分别选择性水解人参皂苷Ｒｂ↓［３］或三七叶苷、Ｒｂ↓［２］、Ｒｃ，皂苷与糖苷酶的重量比为１∶１～１０∶１，温度为３０～４５℃，ｐＨ３．０～５．５，水解时间２小时～３天。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨凌，何克江，韩蔚，吴磊，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]