一种超短产物的聚合酶链式反应方法，依次包括如下步骤： （１）模板变性； （２）引物退火； （３）ＤＮＡ聚合酶催化下延伸合成互补ＤＮＡ链； （４）按步骤（１）－（３）循环进行扩增反应； 其特征在于，扩增反应产物长度为２４－１５０碱基。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学技术，特别是涉及一种聚合酶链式反应的方法及其应用。
技术介绍
聚合酶链式反应是一种高效的扩增特定DNA的方法，在生物医学的各个领域特别是临床诊断上有广泛的应用。聚合酶链式反应有许多参数包括反应液组成成分，反应液体积，反应的变性，退火和延伸温度时间等，其中，PCR反应扩增产物长度也是参数之一。扩增产物长度取决于引物的选择，一旦引物确定扩增产物的长度也就确定了。从历来的研究看引物的设计是PCR的关键，但是对引物的选择上集中在分析引物本身的长度，GC碱基比，3’端互补碱基数，发夹结构强弱等方面，而把扩增产物的长度的选择放在一个很次要，从属的地位。几乎所有的引物设计软件都没有把扩增产物的长度与引物的严谨性联系起来。PCR扩增产物长度通常在150-1000碱基。近年来关于长距离PCR(LD-PCR〕的研究日趋增加，适合扩增长产物的PCR试剂盒也陆续出现，在合适条件下已能扩增出几千至几万碱基长的产物。相对于长产物的扩增研究，对短产物的扩增研究似乎还是一片空白。在PCR专利技术至今的各种有关教科书和实验指南无一例外地指出扩增产物长度在150碱基以上。被广泛应用的引物设计软件Oligo也把扩增产物150碱基作为预设的引物搜寻范围的下限。这些充分说明现有PCR技术形成了产物长度大于150碱基的常识，尚未有专门针对小于150碱基产物的PCR反应进行研究，并且指明扩增短产物带来的特殊技术效果。本专利技术突破现有技术常规，经过对短扩增产物的解链温度等方面的计算，分析和试验，发现扩增短产物可以成为一种普遍应用的PCR方法，具有标准PCR方法所不具备的优点，在检测扩增产物污染(carryover)方面有独特的应用价值。
技术实现思路
所要解决的技术问题本专利技术所要解决的技术问题是提供一种扩增超短产物的聚合酶链式反应方法及其应用，以突破现有PCR方法中扩增产物长度的常规，克服常规PCR反应不能用于区分扩增产物污染的假阳性的缺陷。专利技术构思本专利技术的原理是鉴于一个双链DNA片段的解链温度主要取决于其长度但又和其硷基组成和排列密切有关。当扩增产物长度小于150硷基特别是小于100碱基时，其平均解链温度随链长度减少而显著降低，因而很容易找到引物其扩增产物的解链温度在68-85℃之间，这种扩增产物能在比68-85℃略高的温度下完成变性步骤。我们以长度3000余硷基的乙型肝炎病毒全顺序为例，用引物设计软件随机测试分析了不同长度扩增产物的解链温度(随机方法是在全顺序的1，201，401，601......位分别取长度为30，40，60......的扩增产物各20个左右进行分析〕结果列于表一，统计数据表明当扩增产物长度为30-100硷基时，其平均解链温度从72℃升至83℃，而最低解链温度都低于76℃。超短产物PCR方法为鉴别含基因组DNA的样品中是否存在扩增产物污染提供了简单而有效手段。由污染导致的假阳性是临床PCR检验中的大问题，而要判别确认扩增产物污染也较麻烦。应用超短产物PCR方法，如果样品中不存在扩增产物污染，则必须有至少最初的2个常规变性温度的循环，才可能得到目标扩增产物；反之，如果在超短产物PCR全部反应过程中均应用较低变性温度的情况下，也能得到扩增产物，说明样品有滞后污染。所以在正常检测的同时，做一个PCR反应全程采用低变性温度的对照试验便能作出判断。技术方案本专利技术基于常规的聚合酶链式反应方法，依次包括如下步骤模板变性；引物退火；DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；以及前述步骤的循环。不同之处在于扩增反应产物长度为24-150碱基，优选在24-100碱基范围内，具有最佳效果的长度范围为40-70碱基。产物DNA小于100碱基，平均解链温度显著下降，更明显取决于碱基长短和组成。扩增产物的长度由引物对决定，本专利技术用引物设计软件用自动方法搜寻，也可利用引物设计软件显示的各种图谱用人工方法搜寻。引物本身长度范围为11-40碱基，优选范围18-30碱基。超短扩增产物PCR方法的反应条件见表1。最初的2个循环的变性温度按常规，后续循环的变性温度68-96℃，优选72-80℃。超短扩增产物PCR方法的退火温度范围在40-65℃之间，优选实施温度55-65℃，延伸温度范围为45-72℃，优选实施温度55-65℃。表1.超短扩增产物PCR反应循环条件 采用超短引物进行所说的聚合酶链式反应，使变性温度可以低于常规的94-95℃。将模板样品分别以94-95℃和68-87℃两种变性温度进行最初2个循环的反应，可显著区分待测DNA样品中的模板是长链DNA还是先前扩增产物带来的片段污染，长链DNA在94-95℃可解链，而68-87℃下无法变性，而污染片段在94-95℃和68-87℃两种变性温度均可扩增出阳性结果。所说的超短产物聚合酶链式反应方法在区分基因组DNA和cDNA的检测中同样有其独特应用，设计超短产物的相应引物，将模板样品分别进行2个PCR(1)以94-95℃变性温度进行最初2个循环，后续循环68-87℃变性；(2)以94-95℃变性温度进行最初1个循环，后续循环68-87℃变性。由于基因组DNA在94-95℃可解链，而68-87℃下无法变性，故基因组DNA必须至少有2个高温变性循环，才可完整扩增；而用基因专一的反引物进行反转录得到的互补DNA(cDNA)只需1个高温变性循环即可完整扩增。即基因组DNA在反应(1)中呈阳性，反应(2)中呈阴性；cDNA在反应(1)和(2)中均呈阳性。本专利技术所采用的模板DNA为cDNA，由人肌肉组织总RNA(Clontech公司)利用cDNA制备试剂盒(Clontech公司AdvantageRT for PCR kit)制备，所用引物为试剂盒提供的Oligo(dT)18，PCR体积10μL，每管加1μL 1μg/1λcDNA。本专利技术的PCR反应均采用Clontech公司Advantage 2试剂盒，引物终浓度未指明则为0.5μM。有益效果本专利技术的有益效果归纳如下1超短扩增产物PCR方法可将通常PCR反应循环的退火和延伸合为一步。本专利技术PCR的扩增产物仅24-100碱基，而引物本身长为12-40碱基，所以实际上只需要延伸12-80碱基左右。因为Taq聚合酶在22，37，55或70℃的延伸速度分别为每秒0.25，1.5，22或60个以上核苷酸，所以在使用本专利技术的通用退火温度范围40-65内，能在几至几十秒的时间内完成延伸，不必像标准PCR方法那样在退火步骤后将温度提高到70℃左右Taq酶的最适作用温度范围维持一段时间。所以，超短扩增产物PCR方法每一循环只需要变性和退火延伸二步。2反应快速。标准PCR的退火和延伸步骤通常共需1分半钟，变性时间通常为30秒种，以使解链温度较高的扩增产物能在94-95℃下充分解链。本专利技术的超短扩增产物的解链温度极低，而变性温度控制在比解链温度略高，在采用反应液10微升的条件下，本专利技术的变性时间仅为1秒钟。本专利技术的变性温度在70-85℃之间，而退火延伸温度50-65℃与标准PCR相同。标准PCR的变性温度在94-95℃之间，所以本专利技术方法的变性温度与退火温度之差为5-35℃，而标准PCR的此值为30-45℃，以退火温度55℃为例，本专利技术每一循环的坡道时间比标准P本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐定邦，朱德芬，陆德如，徐文慧，
申请(专利权)人：徐定邦，徐文慧，
类型：发明
国别省市：
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