lncRNA‑NEAT1作为分子病理诊断标志物在制备胶质瘤诊断试剂中的用途制造技术

本发明专利技术公开了一种lncRNA‑NEAT1作为分子病理诊断标志物在制备胶质瘤诊断试剂中的用途。本发明专利技术利用胶质瘤公开数据库筛选与EGFR module和PDGFR module型胶质瘤相关的lncRNA，并通过对胶质瘤病人肿瘤组织的检测，发现在肿瘤组织中能够检测到lncRNA‑NEAT1，并且EGFR module肿瘤组织中的lncRNA‑NEAT1含量明显高于PDGFR module，说明该标志物可用于区分EGFR module型胶质瘤以及PDGFR module型胶质瘤。此外本发明专利技术还提供了一种胶质瘤的诊断试剂盒，并建立了一种诊断胶质瘤的方法，该方法通过PCR方法进行，相较于传统方法，具有成本低、时间段、灵敏度高等优点，能够满足大规模的实验以及临床应用的需要。

LncRNA NEAT1 as molecular pathological diagnosis markers for use in preparation of diagnostic reagent in glioma

The invention discloses a lncRNA NEAT1 as molecular pathological diagnosis markers for use in preparation of diagnostic reagent in glioma. The present invention discloses the use of lncRNA glioma database screening with EGFR module and PDGFR type module glioma related, and through the detection of tumor tissue of patients with glioma can be detected lncRNA NEAT1 in tumor tissue, and the content of NEAT1 EGFR lncRNA module in tumor tissues was significantly higher than that of PDGFR module. The markers can be used to distinguish between EGFR module and PDGFR glioma module glioma. In addition, the invention also provides a kit for diagnosis of glioma, and to establish a method for the diagnosis of glioma by the PCR method, compared with the traditional method, has the advantages of low cost, time and high sensitivity, can satisfy the large-scale experimental and clinical application.

【技术实现步骤摘要】
lncRNA-NEAT1作为分子病理诊断标志物在制备胶质瘤诊断试剂中的用途
本专利技术涉及一种检测胶质瘤的分子病理诊断标志物，特别涉及lncRNA-NEAT1作为分子病理诊断标志物在制备胶质瘤诊断试剂中的用途，还涉及一种胶质瘤诊断试剂盒，本专利技术属于医药

技术介绍
肿瘤的分类为肿瘤的临床治疗以及科研提供了重要的方向，目前医学界普遍采用的胶质瘤分类诊断准则(2007年世界卫生组织标准)在很大程度上基于形态学指标。该分型系统不但未能揭示肿瘤发生发展的生物学本质，且主观性强，不一致性高达40％。分子病理学是利用分子和遗传学方法对肿瘤进行诊断和分类，设计和验证对治疗反应和病情发展的预测性生物标记物，不同的基因构成造成的对肿瘤的个人易感性，还有环境因素和生活方式对肿瘤发生的影响，受主观影响较小，客观性强。科研人员通过对胶质瘤发生发展的核心信号通路的共表达基因谱将胶质瘤分成了EGFRmodule型和PDGFRmodule型，他们之间具有显著不同的遗传学背景和预后。而目前尚缺乏胶质瘤组织中的分子标志物来详尽的阐述其在胶质瘤分子病理学诊断的作用。因此，寻找和发现新的胶质瘤中新的分子标志分子弥补EGFR在分子病理学诊断的不足以提高胶质瘤的诊断水平，是胶质瘤防治研究的重要内容。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种新的胶质瘤分子病理诊断标志物；本专利技术的目的之二是建立一种胶质瘤诊断试剂盒及其诊断方法，以克服传统的检测胶质瘤相关的lncRNA的原位杂交技术具有价格昂贵，实验周期较长以及灵敏度较差的缺点以满足大规模的实验以及临床应用的需要。为了达到上述目的，本专利技术所采用了以下技术手段：本专利技术专利技术人利用胶质瘤公开数据库筛选与EGFRmodule和PDGFRmodule型胶质瘤相关的lncRNA并在临床样本中进行了进一步验证，结果发现lncRNA-NEAT1在EGFRmodule型胶质瘤组织中高表达。在上述研究的基础上，本专利技术提出了lncRNA-NEAT1作为分子病理诊断标志物在制备胶质瘤诊断试剂中的用途。其中，优选的，所述的试剂用于区分EGFRmodule型胶质瘤以及PDGFRmodule型胶质瘤。进一步的，本专利技术还提出了一种胶质瘤诊断试剂盒，所述的试剂盒含有用于扩增lncRNA-NEAT1的引物对，所述的引物对由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。其中，优选的，所述的试剂盒还包括反转录PCR反应液、SYBRPremixExTaqTM荧光染料PCR反应液、MgCl2、dNTP、RNasin、随机引物、反转录酶以及无RNA酶水。使用本专利技术所述的试剂盒用于EGFRmodule型胶质瘤诊断时，按照以下步骤进行：(1)提取待测样本的总RNA(2)反转录对步骤(1)提取得到的总RNA进行反转录得到cDNA模板；(3)荧光定量PCR检测以步骤(2)得到的cDNA为模板，使用所述的引物对进行荧光定量PCR扩增，荧光定量PCR体系为：荧光定量PCR条件为：95℃30s；95℃5s，60℃15s，共进行44个循环，72℃30s，4℃保存；(4)结果判定截断值＝1.52。其中，优选的，所述样本为胶质瘤新鲜病理组织。相较于现有技术，本专利技术的有益效果在于：1、本专利技术提供了一种新的胶质瘤分子病理诊断标志物，该标志物可用于区分EGFRmodule型胶质瘤以及PDGFRmodule型胶质瘤，从而为胶质瘤的治疗提供依据和方向。2、本专利技术提供了一种胶质瘤的诊断试剂盒，并建立了一种诊断胶质瘤的方法，该方法通过PCR方法进行，相较于传统方法，具有成本低、时间段、灵敏度高等优点，能够满足大规模的实验以及临床应用的需要。附图说明图1为6个lncRNA在胶质瘤组织中的表达检测；图2为利用原位杂交检测NEAT1在PDGFRmodule与EGFRmodule病人胶质瘤组织中lncRNA-NEAT1的表达水平；图3为在CGGA，GSE16011，Rembrandt和TCGA数据库中NEAT1在EGFRmodule中的受试者工作特征曲线(ROC)；图4为6对引物检测lncRNA-NEAT1在胶质瘤组织中的表达量；图5为胶质瘤PDGFRmodule与胶质瘤EGFRmodule病人胶质瘤组织中lncRNA-NEAT1的表达检测；图6为NEAT1在EGFRmodule中的ROC曲线。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实施例1lncRNA-NEAT1的筛选、鉴定本专利技术专利技术人利用胶质瘤4大数据库CGGA，Rembrandt，TCGA和GSE16011累计1500例病例中对常见的202个lncRNA进行了筛选发现了6个lncRNA在胶质瘤EGFRmodule型中高表达，并在上述4大胶质瘤权威公开数据库中对这6个lncRNA在U87-MG细胞系中进行PCR验证，结果发现lncRNA-NEAT1在U87-MG细胞系细胞中表达最高(见图1)。利用原位杂交检测PDGFRmodule与EGFRmodule病人胶质瘤组织中lncRNA-NEAT1的表达水平，结果如图2所示。接着在上述4大权威公开数据库中进行了NEAT1在EGFRmodule中的受试者工作特征曲线(ROC)的评价，结果如图3所示。这些结果表明，lncRNA-NEAT1在EGFRmodule型胶质瘤细胞中高表达，因此提示lncRNA-NEAT1可作为分子病理诊断标志物用于EGFRmodule型胶质瘤的检测。实施例2lncRNA-NEAT1作为分子病理诊断标志物在EGFRmodule型胶质瘤检测中的应用1、瘤组织样本的采集、处理及提取其中的RNA(1)胶质瘤组织样本收集：收集胶质瘤患者病理组织。(2)胶质瘤组织样本处理：用PBS冲洗，液氮保存。(3)提取胶质瘤组织中的RNA：每个组织样品均取100mg，研磨成粉末，按照从Sigma公司购买的Trizol提取RNA。(4)反转录成cDNA：每个样品取相同量RNA，用随机引物进行反转录。按照5×M-MLVRTBuffer5μl、MgCl22μl、M-MLVReversetranscriptase1μl、rRNasin0.5μl(Promega公司)、dNTPs1μl、随机引物1μl、提取的RNA2ul、DEPC水(补充H2O使总体积达到20μl)进行反转录。以上步骤所用的tip头、EP管均经过RNA酶灭活处理。2、引物设计与筛选(1)引物设计：利用NCBI查得lncRNA-NEAT1的全长序列(NR_028272.1)，针对lncRNA-NEAT1的序列利用Primerblast网站设计Real-timePCR的6对引物，由北京天一辉远公司负责引物合成。(2)引物筛选：采用TaKaRa公司的SYBRPremixExTaqTM试剂和美国Bio-Rad公司的Bio-Rad实时定量PCR仪，按照下述体系进行PCR反应：PCR条件：按照上述Re本文档来自技高网...

【技术保护点】
lncRNA‑NEAT1作为分子病理诊断标志物在制备胶质瘤诊断试剂中的用途。

【技术特征摘要】
1.lncRNA-NEAT1作为分子病理诊断标志物在制备胶质瘤诊断试剂中的用途。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂用于区分EGFRmodule型胶质瘤以及PDGFRmodule型胶质瘤。3.一种胶质瘤诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有用于扩增lncRNA-NEAT1的引物对，所述的引物对由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括反转录PCR反应液、SYBRPremixExTaqTM荧光染料PCR反应液、MgCl2、dNTP...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡金全，陈群，康春生，蒋传路，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23