The present invention relates to the construction method of the T cell antigen receptor diversity sequencing library and the kit. The method used for human or mouse TRB C gene specific primers were designed, TRB gene amplification of human or mouse T lymphocytes expressing V, D and J, and the two generation sequencing joint synchronization sequence in the amplified product, directly to the TRB gene of V, D and J regions were measured order.
【技术实现步骤摘要】
T细胞抗原受体多样性测序文库的构建方法以及试剂盒
本专利技术涉及T细胞抗原受体(TCR)测序文库的构建方法以及用于构建T细胞受体测序文库的试剂盒。
技术介绍
淋巴细胞通过其表面抗原识别受体识别特异性抗原,对抗原识别的特异性体现在克隆水平,也就是同一克隆的淋巴细胞具有相同的抗原受体,识别同一抗原表位。T细胞抗原受体(TCR)是T细胞表面特异性识别抗原和结合抗原肽-MHC分子的分子结构。TCR可分为TCRα/β和TCRγ/δ两种类型,外周血T细胞主要是TCRα/βT细胞,是介导机体特异性细胞免疫反应的主要细胞。外周血T细胞TCR的多样性由α链和β链的V区决定,Vα和Vβ各有3个高度可变区,又称为互补决定区(CDR),即CDR1、CDR2和CDR3。但只有CDR3直接与抗原相互作用,在TCR识别抗原过程中具有核心地位,序列具有高度可变性,被认为是T细胞克隆来源的标识。从基因水平来讲,CDR1、CDR2仅由V基因片段编码,而Vβ的CDR3由V-D-J三个基因片段编码,Vα的CDR3则由V-J两个基因片段编码。多个基因片段编码增加了CDR3的变异,加之重排过程中的N区核苷酸插入和连接的变异性也集中在CDR3区,这些都丰富了CDR3的多样性。T细胞抗原受体β基因座(TRB)是编码TCR分子中β肽链的基因座。原始状态下TRB基因座包含V(可变区),J(结合区),D(多变区)和C(恒定区)四个区域。除了C(恒定区)外,V、J、D均含有若干等位基因(如人的V基因有39-41个功能性等位基因)。在T细胞发育过程中,TRB基因座内发生DNA重组,首先一个D与一个J重组连接,紧接 ...
【技术保护点】
用于构建人或动物TRB基因V,D和J区的测序文库的方法,所述方法包括从受试者的生物样品提取总RNA,基于模板转换技术对TRB基因的V,D和J区进行反转录在cDNA的3’端添加共有序列和分子标签,并随后进行多轮巣式PCR,同时将测序接头序列添加到终产物中,所述反转录和巣式PCR中使用的下游引物为针对共有序列和TRB基因C区设计的嵌套TRBC特异性引物,上游引物为基于模板转换技术中待引入反转录产物中的共有序列和分子标签设计的引物,反转录和每轮巣式PCR的扩增体系中只使用一条下游引物和一条上游引物,优选地,所述TRB基因为人TRB基因或鼠TRB基因,优选地,所述受试者的生物样品是人或小鼠的肿瘤组织;外周血白细胞;包含淋巴细胞的胸水腹水、关节液、脑脊液;以及选自如下的组织器官:脾脏、淋巴结、皮肤。
【技术特征摘要】
1.用于构建人或动物TRB基因V,D和J区的测序文库的方法,所述方法包括从受试者的生物样品提取总RNA,基于模板转换技术对TRB基因的V,D和J区进行反转录在cDNA的3’端添加共有序列和分子标签,并随后进行多轮巣式PCR,同时将测序接头序列添加到终产物中,所述反转录和巣式PCR中使用的下游引物为针对共有序列和TRB基因C区设计的嵌套TRBC特异性引物,上游引物为基于模板转换技术中待引入反转录产物中的共有序列和分子标签设计的引物,反转录和每轮巣式PCR的扩增体系中只使用一条下游引物和一条上游引物,优选地,所述TRB基因为人TRB基因或鼠TRB基因,优选地,所述受试者的生物样品是人或小鼠的肿瘤组织;外周血白细胞;包含淋巴细胞的胸水腹水、关节液、脑脊液;以及选自如下的组织器官:脾脏、淋巴结、皮肤。2.根据权利要求1的方法,其中,在反转录和巣式PCR中,上一轮产物作为下一轮PCR的模板,并且下一轮PCR中使用的TRBC特异性引物相比上一轮PCR中使用的TRBC特异性引物更靠近C区的5’端,除第一轮PCR以外的后续PCR引物均带有部分测序接头序列并且上游引物和下游引物均与上一轮的上游引物和下游引物分别部分重叠。3.根据权利要求1或2的方法,其中,在除第一轮PCR以外的后续PCR中上游引物连接的部分测序接头是illumina部分P5测序接头;下游引物连接的部分测序接头是illumina部分P7测序接头。4.根据权利要求1-3任一项的方法,其中基于模板转换技术中使用如下的上游引物和下游引物进行用于人TRB基因V,D和J区的反转录:上游引物为:5’-AAGCAGUGGTAUCAACGCAGAGUNNNNUNNNNUNNNNUCTT(rG)3-3’(SEQIDNO:4);下游引物为:5’-CAGTATCTGGAGTCATTGA-3’(SEQIDNO:9)。5.根据权利要求1-3任一项的方法,其中基于模板转换技术中使用如下的上游引物和下游引物进行用于鼠TRB基因V,D和J区的反转录:上游引物为:5’-AAGCAGUGGTAUCAACGCAGAGUNNNNUNNNNUNNNNUCTT(rG)3-3’(SEQIDNO:4);下游引物为:5’-CTCCTTGCCATTCACCCACC-3’(SEQIDNO:1)。6.根据权利要求4的方法,其中进行三轮巣式PCR,所用的引物如下:第一轮PCR引物:上游引物:5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAG-3’(SEQIDNO:5);下游引物:5’-GTGTGGCCTTTTGGGTGTGG-3’(SEQIDNO:10);第二轮PCR引物:上游引物:5’-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAAGCAGTGGTATCAACGCAG(SEQIDNO:12);下游引物:5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCTGATGGCTCAAACACAGC-3’(SEQIDNO:11);第三轮PCR引物:上游引物:5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG-3’(SEQIDNO:7);下游引物:5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-barcode-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTG-3’(SEQIDNO:8)。7.根据权利要求5的方法,其中进行三轮巣式PCR,所用的引物如下:第一轮PCR引物:上游引物:AAGCAGTGGTATCAACGCA(SEQIDNO:5)下游引物:CACGAGGGTAGCCTTTTGTT(SEQIDNO:2)第二轮PCR引物:上游引物:TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAAGCAGTGGTATCAACGCA(SEQIDNO:6)下游引物:GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTTGGGTGGAGTCACATTTC(SEQIDNO:3)第三轮PCR引物:上游引物:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG(SEQIDNO:7)下游引物:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-barcode-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTG(SEQIDNO:8)。8.根据权利要求4的方法,其中进行两轮巣式PCR,所用的引物如下:第一轮PCR引物:上游引物:5’-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAAGCAGTGGTATCAACGCAG(SEQIDNO:12);下游引物:5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCTGATGGCTCAAACACAGC-3’(SEQIDNO:11);第二轮PCR引物:上游引物:5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG-3’(SEQIDNO:7);下游引物:5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-barcode-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTG-3’(SEQIDNO:8)。9.根据权利要求5的方法,其中进行两轮巣式PCR,所用的引物如下:第一轮PCR引物:上游引物:TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAAGCAGTGGTATCAACGCA(SEQIDNO:6)下游引物:GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTTGGGTGGAGTCACATTTC(SEQIDNO:3)第二轮PCR引物:上游引物:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG(SEQIDNO:7)下游引物:CAA...
【专利技术属性】
技术研发人员:冯林,张雅静,郭丽萍,刘玲玲,匡满超,程书钧,张开泰,肖汀,张文,
申请(专利权)人:中国医学科学院肿瘤医院,
类型:发明
国别省市:北京,11
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