一种逆转录病毒载体介导HSV1的方法技术

一种逆转录病毒载体介导HSV1的方法，用DNA重组技术将单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV1tk）定向克隆入逆转录病毒载体pLXSN，并用限制性内切酶进行酶切及测序鉴定；用PolyFect Transfection试剂介导重组逆转录病毒转染入包装细胞系PT67，通过G418筛选建立稳定产病毒的细胞株，将病毒感染人胃癌细胞，检测HSV1tk自杀基因治疗系统在体外的抗肿瘤效应。经酶切鉴定和DNA序列测定，HSV1tk基因成功定向插入到pLXSN载体中；重组病毒DNA转染包装细胞，筛选出对G418具稳定抗性的克隆PT67／tk，扩大培养，获取病毒滴度为4×１０４cfu/mL的重组逆转录病毒培养液；感染胃癌细胞SGC7901后再筛选出G418抗性克隆株SGC7901／tk。丙氧鸟苷（GCV）对SGC7901/tk有明显杀伤作用，对SGC7901无明显毒性，证明该病毒表达HSV1tk基因具有生物活性。

A method of mediated HSV1 mediated by retroviral vector

A method of retroviral mediated HSV1, the herpes simplex virus thymidine kinase by recombinant DNA Technology (HSV1tk) was cloned into the retroviral vector pLXSN was identified with enzyme digestion and sequencing by restriction endonuclease; using PolyFect Transfection reagent mediated by recombinant retrovirus transfected into packaging cell line PT67 by G418 establish a stable virus producing cell line, the virus infection of human gastric cancer cells, detection of HSV1tk gene therapy system Dutch act antitumor effect in vitro. By enzyme digestion and DNA sequencing, the HSV1tk gene was successfully inserted into the pLXSN vector; recombinant virus DNA was transfected into packaging cells, selected for cloning of PT67 / TK, G418 with stable resistance extended culture medium for obtaining virus titer was 4 * 104cfu/mL recombinant retrovirus infection; SGC7901 gastric cancer cells and then screened G418 resistant clone of SGC7901 / tk. Propanoside (GCV) has an obvious killing effect on SGC7901/tk, and has no obvious toxicity to SGC7901. It is proved that the virus expressed the HSV1tk gene to be bioactive.

【技术实现步骤摘要】
一种逆转录病毒载体介导HSV1的方法
本专利技术涉及一种逆转录病毒载体介导HSV1的方法，具体地说是以一种逆转录病毒载体介导HSV1的方法。
技术介绍
目前公知的肿瘤的基因治疗，特别是自杀基因治疗，已经成为继传统手术切除、放射治疗、化学药物治疗等疗法之后一种新的抗肿瘤治疗措施。目前应用的肿瘤自杀基因治疗系统主要有单纯疱疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶtk）、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶（ＶＺＶtk）、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（ＥＣＣＤ）；P53等。单纯疱疹病毒胸苷激酶／丙氧鸟苷（ＨＳＶtk／ＧＣＶ）治疗系统为最常用、最重要的治疗系统之一。
技术实现思路
诊断标准：研究对象：材料与方法；pIC19R/MC1tk质粒（克隆了HSV1tk的载体质粒）pLXSN逆转录病毒表达载体、病毒包装细胞PT67均购自美国Clontech公司；人胃癌细胞SGC7901和小鼠NIH3T3细胞均购自中山医科大学细胞库；EcoliDH5α菌株由本校生化教研室保存。试剂；高纯度质粒提取试剂盒和DNA片段凝胶回收试剂盒均购自上海sangon生物工程技术有限服务公司；DNA片段连接试剂盒，购自广州宝泰克生物科技有限公司；转染试剂盒PolyfectTransfection为QIAGEN公司产品；多聚阳离子（Polybrene）、G418、GCV均为Sigma公司产品；DMEM、胎牛血清和RPMI1640均为Gibco公司产品；新生牛血清为杭州四季青公司产品。质粒的抽提、酶切、DNA片段的连接、转化，按Sambrook法或试剂盒产品说明书的方法进行，提取的质粒DNA浓度与纯度用RNADNACaculator测定。重组质粒的构建pIC19R/MCItk质粒和逆转录病毒表达载体pLXSN质粒均转化DH5α后扩增、抽提纯化，均用限制性内切酶EcoRI/BamHI酶切，凝胶电泳证实pIC19R/MCItk质粒有17kbHSV1tkcDNA目的片段，回收、纯化此tk基因片段及pLXSN载体双酶切后的大片段，在适当的反应体系中用DNA片段连接试剂盒将tk基因定向克隆入逆转录病毒表达载体pLXSN中，构建成重组的pLXSNtk质粒。限制性内切酶鉴定和序列鉴定，重组质粒经转化、扩增、提纯后，采用EcoRI、BamHI单酶切和EcoRI／BamHI双酶切，酶切后采用琼脂糖凝胶电泳鉴定，图象分析仪拍照、分析。然后分别在pLXSN载体上单克隆位点中的EcoRI、BamHI酶切位点上下游附近各选23个碱基的片段为测序引物，将新构建pLXSNtk质粒进行测序。细胞培养；包装细胞PT67、小鼠NIH3T3细胞分别培养于含体积分数为10%的新生牛血清的DMEM高糖培养液和RPMI1640培养液中，置于37℃、体积分数为5%的ＣＯ２的培养箱内，25g/L胰酶EDTA消化传代。将细胞置于梯度浓度的G418中，观察细胞对G418敏感性，确定G418筛选浓度：PT67细胞为400mg/L，NIH3T3细胞为300mg/L。PT67的转染及阳性克隆细胞的筛选取4×１０５／孔PT67接种于35mm的6孔培养板，待次日融合率达80%左右时，将25μg的重组质粒DNA用不含血清的培养液稀释至体积为150μL，再加入15μL的PolyFectTransfection试剂混匀，室温放置10min后，再加入1mL的完全培养液，混匀后，立即把转染混合物转移到PT67细胞的培养板中，培养2d后，用G418（400mg/L）筛选2周，获得抗性细胞集落后，再用25g/L胰酶消化，以1∶１０继续传代，在含500mg/L以上G418的选择性培养液中分别扩大培养，选择最高抗性克隆留种，命名为PT67／tk细胞；NIH3T3的感染及病毒滴度的测定；收集PT67／tk细胞上清液，以045μm的过滤器过滤，进行10、10２、１０３、１０４、１０５、１０６倍系列稀释，加入对数生长期NIH3T3细胞，随后加Polybrene至终浓度为8mg/L，2d后更换含300mg／LG418的选择培养液，连续筛选2周后，观察各稀释度中抗性细胞（NIH3T3/tk）克隆数（m），按“滴度（cfu/mL)=m×稀释度”测定病毒滴度(其中cfu为colonyformingunits)。人胃癌细胞的感染及GCV对其体外杀伤效应的测定；同上方法感染人胃癌细胞SGC7901，感染后癌细胞用G418筛选2周，获得抗性细胞克隆，命名为SGC7901／tk，将它与SGC7901分别等量接种于24孔板，各12孔，各选6孔分别加入100mg/L的GCV，余下各6孔为不加药对照组，3d内用台盼蓝染色活细胞计数法计算SGC７９０１／tk―ＧＣＶ、SGC７９０１／tk、SGC７９０１―ＧＣＶ、SGC７９０１共4组活细胞数目，记为n、n０、n′、n′０，按n／n０（n′／n′０）×100％计算生存率pＳr、pＳr′。结果：重组质粒的构建和鉴定；提纯所得质粒DNA的光密度D（260nm/280nm）比值为17～22。EcoRI/BamHI双酶切后的pIC19R/MC1tk质粒，经琼脂糖凝胶电泳显示有17kb的DNA片段；逆转录病毒载体pLXSN质粒经EcoRI、BamHI单酶切后显示为59kb的DNA带，新构建的pLXSNtk质粒经EcoRI/BamHI双酶切后，琼脂糖凝胶电泳显示2条DNA带，分别为17kb和59kb左右。新构建的pLXSNtk质粒结构，分析测序结果，碱基序列与文献报道一致，证明HSVtk基因已被定向克隆入pLXSN载体中。pLXSNtk转染包装细胞PT67的结果；转染后，用400mg/L的G418筛选2d后，细胞开始死亡，在4～５d内死亡达到高峰，5d后有少数细胞贴壁生长，再过1周，这些细胞逐渐形成阳性克隆细胞团，用最终高达1g/L的G418筛选到的PT67／tk扩大培养后，收集病毒液，感染NIH3T3测定病毒滴度，经测定滴度为4×１０４cfu/mL。专利技术目的：HSVtk基因在肿瘤细胞内表达胸苷激酶，可催化核苷类似物，如丙氧鸟苷（GCV）等，形成单磷酸化产物，并在细胞内磷酸激酶作用下形成三磷酸产物，干扰细胞分裂时DNA合成，从而导致肿瘤细胞死亡。但由于在体内不可能每一肿瘤细胞都导入自杀基因，故旁观者效应（bystandereffect）对基因治疗效果起到至关重要的作用。旁观者效应不仅可使导入自杀基因的细胞杀死，还使邻近未导入的细胞也被杀死。技术方案：用DNA重组技术将单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV1tk）定向克隆入逆转录病毒载体pLXSN，并用限制性内切酶进行酶切及测序鉴定；用PolyFectTransfection试剂介导重组逆转录病毒转染入包装细胞系PT67，通过G418筛选建立稳定产病毒的细胞株，将病毒感染人胃癌细胞，检测HSV1tk自杀基因治疗系统在体外的抗肿瘤效应。经酶切鉴定和DNA序列测定，HSV1tk基因成功定向插入到pLXSN载体中；重组病毒DNA转染包装细胞，筛选出对G418具稳定抗性的克隆PT67／tk，扩大培养，获取病毒滴度为4×１０４cfu/mL的重组逆转录病毒培养液；感染胃癌细胞SGC7901后再筛选出G418抗性克隆株SGC7901／tk。丙氧鸟苷（GCV）对SGC7901/tk有明显杀伤作用，对SGC7901无明显毒性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种逆转录病毒载体介导HSV1的方法，用PolyFect Transfection试剂介导重组逆转录病毒转染入包装细胞系PT67，通过G418筛选建立稳定产病毒的细胞株，将病毒感染人胃癌细胞，检测HSV1tk自杀基因治疗系统在体外的抗肿瘤效应；经酶切鉴定和DNA序列测定， HSV1tk基因成功定向插入到pLXSN载体中；重组病毒DNA转染包装细胞，筛选出对G418具稳定抗性的克隆PT67／tk，获取病毒滴度为4×１０４cfu/mL的重组逆转录病毒培养液；感染胃癌细胞SGC7901后再筛选出G418抗性克隆株SGC7901／tk；丙氧鸟苷（GCV）对SGC7901/tk有明显杀伤作用，对SGC7901无明显毒性。

【技术特征摘要】
1.一种逆转录病毒载体介导HSV1的方法，用PolyFectTransfection试剂介导重组逆转录病毒转染入包装细胞系PT67，通过G418筛选建立稳定产病毒的细胞株，将病毒感染人胃癌细胞，检测HSV1tk自杀基因治疗系统在体外的抗肿瘤效应；经酶切鉴定和DNA序列测定，HSV1tk基因成功定向插入到pLXSN载体中；重组病毒DNA转染包装细胞，筛选出对G418具稳定抗性的克隆PT67／tk，获取病毒滴度为4×１０４cfu/mL的重组逆转录病毒培养液；感染胃癌细胞SGC7901后再筛选出G418抗性克隆株SGC7901／tk；丙氧鸟苷（GCV）对SGC7901/tk有明显杀伤作用，对SGC7901无明显毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨美宁，
申请(专利权)人：杨美宁，
类型：发明
国别省市：甘肃,62