用半胱氨酸合成酶基因制备富含丝氨酸的蛋白质的方法技术

一种制备异种蛋白的方法，其包括在培养介质中培养含有半胱氨酸合成酶（ｃｙｓＫ）基因和编码异种蛋白基因的细菌，由此产生异种蛋白，并收集异种蛋白的步骤。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及富含丝氨酸的蛋白质的制备方法，其包括培养含半胱氨酸合成酶(cysK)基因和编码异种蛋白基因的细菌。更具体而言，本专利技术涉及一种制备富含丝氨酸的蛋白质的方法，其包括培养既含富含丝氨酸的异种蛋白基因又含半胱氨酸合成酶(cysK)基因的细菌，并从中分离富含丝氨酸的异种蛋白。
技术介绍
E.coli是合成和制备异种蛋白的常用菌株，通过重组技术该菌株被用于生产蛋白质，诸如干扰素，白介素2，集落刺激因子，生长激素，胰岛素样生长因子和人血清白蛋白的制备中。为了能在E.coli中有效得制备异种蛋白，需要有表达异种蛋白的质粒载体，适宜的培养条件，抑制所制得的异种蛋白降解的条件及类似条件，目前已经开发出了多种满足这些必要条件的系统(system)(Weickert et al.，Curr.Opin.Biotechnol.，7494-9,1996)。然而，还存在一个问题，当使用目前常规的方法时，很难提高制备异种蛋白的产率，这是因为诱导表达后需要大量的时间。为了克服这一问题已付出了很多努力，但仍没有见到令人满意的结果的报导。因此需要继续开发一种能够得到高产率的，由E.coli制备异种蛋白的方法。鉴于此，本专利技术人通过研究开发了一种能够得到高产率的，由E.coli制备异种蛋白的方法。我们发现在E.coli中制备富含丝氨酸的异种蛋白时，通过使编码富含丝氨酸的异种蛋白基因和来源于细菌的半胱氨酸合成酶(cysK)基因共表达，能够使制备富含丝氨酸的异种蛋白的产率得以提高，从而完成本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种制备异种蛋白的方法，包括培养一种既含cysK基因又含编码异种蛋白基因的细菌。本专利技术的另一个目的是提供一种用包含编码异种蛋白基因的重组载体和包含cysK基因的重组载体同时进行转化的细菌，和一种用既含cysK基因又含编码异种蛋白基因的重组载体进行转化的细菌。本专利技术的再一目的是提供一种制备异种蛋白的方法，其是通过用cysK基因或包含cysK基因的重组载体进行转化微生物来制备的。根据本专利技术，上述目的及其它目的可以通过提供一种制备异种蛋白的方法得以实现，该方法包括培养一种包含cysK基因和编码异种蛋白基因的细菌。根据本专利技术，细菌可以用一种包含cysK基因和编码异种蛋白基因的载体进行转化。任选地，细菌还可以通过包含cysK基因的载体和包含编码异种蛋白基因的载体进行转化。本专利技术的另一个方案在于提供一种包含cysK基因和编码异种蛋白基因的重组载体。本专利技术的又一个方案在于提供一种细菌，该细菌用包含cysK基因的载体和包含编码异种蛋白基因的载体进行转化。本专利技术的再一个方案在于提供cysK基因或包含cysK基因的重组载体在被转化的微生物中制备异种蛋白的方法中的应用。根据本专利技术，cysK基因是从E.coli中得到，异种蛋白选自富含丝氨酸的蛋白质。富含丝氨酸的蛋白质包括肥胖蛋白(leptin)、IL-12P40(白细胞介素12 β链)，但不受限于此。在此，对本专利技术进行详细描述。首先，对本专利技术使用的术语进行如下定义。本专利技术所用的术语“富含特定氨基酸的蛋白质”指的是一种蛋白质，它包含一种超过E.coli中平均氨基酸组成的特定氨基酸(Koonin et al.，inEscherichia coli and SalmonellaCellular and Molecular Biology(eds.Neidhardt，F.C.et al.)American Society for Microbiology，Washington，DC，2203-17，1996)。所用术语“富含丝氨酸的蛋白质”定义为蛋白质中的丝氨酸在氨基酸成分中的含量为10％或更多，且在蛋白质中的含量至少排名第二。根据目前了解的事实，如果通过DNA重组技术在E.coli中生产富含丝氨酸的蛋白质如肥胖蛋白，制备肥胖蛋白的方法涉及高浓度培养转化的E.coli，肥胖蛋白表达的诱导，肥胖蛋白的表达，转化的E.coli的分离和E.coli中肥胖蛋白的提取。制备肥胖蛋白时，从诱导表达起至达到最大的含量需要超过8个小时。本专利技术通过二维电泳确认了需要如此长的时间表达是因为，当产生肥胖蛋白的E.coli以高浓度培养时抑制了E.coli中的丝氨酸家族氨基酸的生物合成途径(图1)。本专利技术的专利技术人发现通过编码促进丝氨酸家族氨基酸合成的半胱氨酸合成酶基因和富含丝氨酸的蛋白质基因的共表达，与只表达一种富含丝氨酸的蛋白质基因相比，可使制备富含丝氨酸蛋白质的时间缩短，并由此导致产率的增加。通过以下实施例对本专利技术进行详细描述。然而，对于本领技术人员而言，显然，这些实施例只是用于举例说明，本专利技术并不受限于此。附图说明结合如下附图进行详细描述能够充分理解本专利技术进一步的目的和优点图1是显示用重组E.coli诱导肥胖蛋白表达之前和之后的细胞中GlyA和CysK蛋白质的表达水平的曲线图。图2是pAC104CysK质粒的基因图。图3是pEDIL-12p40质粒的基因图。图4a是在培养能产生肥胖蛋白的E.coli BL21(DE3)(pEDOb5)时，随着培养时间的不同，细胞密度、干细胞重量和异种蛋白数量发生变化的曲线图。图4b是在培养能产生肥胖蛋白与共表达cysK基因的重组E.coliBL21(DE3)(pEDOb5)(pAC104CysK)时，随着培养时间的不同，细胞密度、干细胞重量和异种蛋白数量发生变化的曲线图。图5a是显示E.coli蛋白中的氨基酸组成的曲线图。图5b是显示肥胖蛋白中的氨基酸组成的曲线图。图5c是显示G-CSF中的氨基酸组成的曲线图。图5d是显示IL-12p40中的氨基酸组成的曲线图。图6a是在培养能产生IL-12p40的重组E.coli BL21(DE3)(pEDIL-12p40)时，随着培养时间的不同，细胞密度、干细胞重量和异种蛋白数量发生变化的曲线图。图6b是在培养能产生IL-12p40与共表达cysK基因的重组E.coliBL21(DE3)(pEDIL-12p40)(pAC104CysK)时，随着培养时间的不同，细胞密度、干细胞重量和异种蛋白数量发生变化的曲线图。具体实施例方式实施例1利用二维电泳测定肥胖蛋白生产菌的生理性变化根据已知方法，采用二维电泳比较E.coli BL21(DE3)(pEDOb5)中的人源肥胖蛋白过量产生之前和之后的蛋白质水平的变化(Hochstrasseret al.，Anal.Biochem.，173424-5，1988；Han et al.，J.Bacteriol.，183301-8,2001)即在E.coliBL21(DE3)(pEDOb5)预培养之后，诱导肥胖蛋白的表达并在高浓度下进行培养。取出诱导表达之前和之后的培养肉汤。每一种培养肉汤在4℃，以6000rpm转速下离心5分钟，得到的沉淀物用500μl的低盐缓冲液(KCl 3mM，KH2PO41.5mM，NaCl 68mM，NaH2PO49mM)清洗。然后，将产物悬浮在200μl的TE缓冲液中(Tris-HCl 10mM，EDTA 1mM)。悬浮液用声波降解器进行声波降解，并在4℃时，以12000rpm转速下离心10分钟。弃去上清液，真空干燥固体并在-20℃下储存，作为随后的测试样品备用。将200μ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：李相烨，韩美正，
申请(专利权)人：韩国科学技术院，
类型：发明
国别省市：