抑制凋亡过程及改善细胞性能制造技术

本发明专利技术涉及通过在细胞内表达一种或多种抗凋亡多肽来防止或延迟程序性细胞死亡，从而防止或延迟细胞内程序性细胞死亡。本发明专利技术还涉及通过在细胞内表达一种或多种抗凋亡多肽来提高细胞相关产物的产量，从而提高该细胞的细胞相关产物的产量。本发明专利技术还提供了用于产生细胞相关产物或用于细胞性治疗的重组细胞。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及防止或延迟重组细胞的程序性细胞死亡。更具体而言，本专利技术涉及通过在细胞中表达一种或多种抗凋亡多肽来抑制重组细胞的程序性细胞死亡。本专利技术进一步涉及通过在细胞内表达一种或多种抗凋亡多肽来提高重组细胞的细胞相关产物、例如重组蛋白质如抗体的产量。此外，本专利技术提供了表达抗凋亡多肽的重组细胞。这种细胞可用于细胞性治疗或用于产生细胞相关产物，特别是在大规模生物反应器中的商品化生产。
技术介绍
在制药或商品化生产环境中，利用真核细胞生产高价值的治疗性或诊断性蛋白质，受到有关可利用的发酵罐体积及发酵进行时间的严格限制。从经过一段时间制备成批发酵物来看，生产效率来自于使运行中每单位时间内的蛋白质生成速率最高，使运行停止时间最短，并使生产效率较低时的运行时间部分最少。提高容器中的细胞密度是在生产中提高蛋白质产率的一个主要方法。通过营养补料方法、并利用保留细胞的系统灌注培养基，形成适当平衡的培养基组成，可以显著提高细胞密度。这些方法除了提高细胞密度之外，还能有效提高分批培养物的整体寿命。提高制备产率的另一基本方法是提高细胞自身生成蛋白质的速率，即提高比细胞产率(产生蛋白质的量/细胞/天)。传统上，获得具有高生产速率细胞的方法来自一个多步骤的过程，其中第一步利用目的蛋白质的基因转染大的细胞群体，第二步长出较大群体的单细胞克隆，鉴定并选择较高的生产细胞系，进一步建立细胞系。在转染细胞群体中显现蛋白质生产速率的不均一性，其原因一般在于，首先是新的遗传物质在宿主细胞基因组中的整合位置的差异，其次是所整合的DNA序列总数(拷贝数)的差异。因此，还已开发了在宿主基因组中定位异源DNA整合位点的方法，以便将DNA序列整合到与高水平转录为RNA有关的位点。这些方法的例子中，关于NEOSPLA载体由美国专利5,648,267、5,733,779、6,017,733和6,159,730提供，关于同源重组则由美国专利5,830,698和5,998,144提供。通过共转染目的蛋白质的基因与可赋予毒剂抗性的另一蛋白质基因，也提供了选择高生产细胞的方法。通过将生长中的细胞暴露给浓度增加的这样一种毒剂，可以选择具有较高抗性基因拷贝数的细胞。常常发现这些细胞经历抗性基因的基因组扩增过程。编码目的蛋白质的相邻基因共同扩增，常引起目的蛋白质的细胞比产率水平提高(Ringold，J.Mol.Appl.Genetic 1(3)165-75(1981)；Kaufman，J.Mol.Biol.159(4)601-21 1982)。在起源完全不同于生物化学工程细胞培养制备过程的生物学研究领域，过去十年来对程序性细胞死亡过程-凋亡已经颇为了解。与这些发展随之而来的概念性突破是，存在导致细胞死亡的天然生理学过程。当然，细胞死亡也可以是破坏细胞完整性的创伤所致直接和立即的结果，从而使细胞或其遗留物发生坏死。作为疾病病程的一部分，或者对生理压力的响应，凋亡可由自然的或自然发育的多种环境或刺激物启动。例如，器官成熟或重组的发育过程涉及特定类型细胞的死亡，以便为其它新型细胞的出现让路。在遗传及生物化学水平上理解凋亡，并探索其干预方法，使之或促进、或终止，已成为医学科学中相当令人关注的领域。然而，已经开始将凋亡理解为哺乳动物细胞体外培养过程中势必发生的细胞死亡的主要途径。在实验室和大规模制备环境中进行的细胞培养的基本形式称为分批培养。分批培养开始于健康的、活跃生长的细胞接种物；培养物生长到峰值细胞密度，进入衰退期，然后经历直至细胞群体相继死去的过程。在后来的细胞培养衰退期，营养物开始耗尽，毒性代谢物浓度上升，环境变得对细胞形成压力。另外，发酵环境本身可以产生其它压力因素，例如硬件产生的剪切力、与搅拌有关的流体和气体涡流，以及培养物通过管线的流动。已经证明，所有这些因素(营养限制、培养基中毒物及物理压力)均可启动培养中细胞的凋亡，从而整体上在限制培养物预期寿命中起作用。最近发现了几种在凋亡过程中起关键作用的蛋白质，并分离和克隆了它们的基因。腺病毒蛋白质E1B-19K是Bcl-2蛋白质家族的抗凋亡成员。细胞对感染的响应是启动凋亡级联。该防御机制用于从组织中去除被感染的细胞。然而，某些病毒通过编码表达于感染过程早期的、可抑制凋亡的蛋白质，从而发展了对抗凋亡响应的方法。在腺病毒感染过程中，由腺病毒基因组的E1区调节病毒基因在细胞中表达。E1区由E1A和E1B两个转录单位组成。E1B单位编码腺病毒的两个不同肿瘤抗原，19kDa和55kDa蛋白质。凋亡抑制剂E1B-19K的作用可理解为类似于抗凋亡蛋白质Bcl-2，可在细胞死亡途径的多个阶段抑制凋亡。据认为凋亡抑制的一个机理是通过稳定线粒体膜，从而防止将细胞色素C和其它前凋亡因子释放到胞质溶胶中。(VanderHeiden Cell 91(5)627-37(1997))。细胞色素C参与结合到涉及启动天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)级联的复合物中的Apaf-1。Zou J.Biol.Chem.274(17)11549-56(1999)。Bcl-2家族成员(Bcl-XL)也通过直接结合Apaf-1来阻断Apaf-1的活化。(Hu等人，J.Biol.Chem 273(10)5481-5(1998)；PNAS 95(8)4386-91(1998))。普遍存在的膜蛋白质Aven是另一种抗凋亡蛋白质。Aven的抗凋亡活性是由于其能够干扰天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活化子Apaf-1的自我缔合，从而抑制天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶9活化(Chau Mol.Cell.631-40(2000))。已经表明，Aven还增强Bcl-XL在BHK(baby hamster kidney)细胞中的抗凋亡活性，提示Aven和Bcl-XL之间存在相互作用(Chau(2000))。上述提高蛋白质产量的各种方法均成功进行了不同程度的实践。尽管如此，仍然需要发展提高细胞相关产物、例如重组蛋白质产量的方法，特别是在大规模商品化生产中。此外还需要发展防止或延迟程序性细胞死亡的方法。专利技术概述及目的本专利技术的一个目的在于提供防止或延迟重组细胞程序性细胞死亡的方法，其中该细胞不是小鼠骨髓瘤细胞。该方法包括在细胞中表达或诱导表达一种或多种抗凋亡多肽，例如细胞性Bcl-xL、Bcl-2、Aven、或病毒性蛋白质E1B-19K和p35，以便防止或延迟细胞程序性死亡，其中如果在细胞中表达一种抗凋亡多肽，则该抗凋亡多肽不是Bcl-xL相互作用因子，例如Aven。更具体而言，本专利技术的一个目的在于，提供防止或延迟包含编码一种或多种目的多肽的一种或多种异源多核苷酸的重组细胞程序性细胞死亡的方法，该目的多肽为例如，抗体如抗CD154(IDEC-131)、抗CD20抗体(例如RITUXAN，FDA批准用于治疗非霍奇金(non-Hodgkin’s)淋巴瘤的嵌合抗CD20，由ATCC登录号69119生成，ZevalinTM)、抗CD80(IDEC 114)抗体、抗CD23抗体(IDEC 152)、抗CD4抗体(IDEC 151)、以及抗肿瘤抗原抗体、酶、受体、细胞因子、细胞表面因子、细胞代谢物、细胞分泌因子、病毒性因子以及膜结合因子。本专利技术另一目的在于提供提高重组细胞的细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
防止或延迟重组细胞中程序性细胞死亡的方法，其中该细胞不是小鼠骨髓瘤细胞，其包含在细胞内表达一种或多种抗凋亡多肽，以便防止或延迟细胞的程序性细胞死亡，其中如果在细胞内表达一种抗凋亡多肽，则该抗凋亡多肽不是Ａｖｅｎ。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：M里夫，MJ贝滕鲍格，B小菲格罗亚，E埃罗，M哈德维克，
申请(专利权)人：IDEC药物公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]