一种制备D-氨基酸氧化酶的方法技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，涉及一种制备黄素酶Ｄ－氨基酸氧化酶的方法。具体涉及，通过构建重组工程菌株获得高效生产突变Ｄ－氨基酸氧化酶的方法。本发明专利技术通过基因工程手段改造来源于三角酵母Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓｖ　　ｖｉａｂｌｌｉｓ的野生型Ｄ－氨基酸氧化酶，将一段Ｈｉｓｔａｇ融合于野生型酶的Ｎ末端和Ｃ末端，进而通过亲和层析实现突变酶的高效快速分离。酶在发酵液中的表达水平为４０００ＩＵ／ｍＬ，高于野生型酶，Ｎｉ柱亲和层析的回收率为５０％。纯化的酶可用于高效氧化转化头孢菌素Ｃ－产生戊二酰－７－ＡＣＡ，与ＧＬ－７－ＡＣＡ酰化酶联用可生产７－ＡＣＡ。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种制备Ｄ－氨基酸氧化酶的方法，其特征是将Ｄ－氨基酸氧化酶基因修饰后转化甲醇酵母宿主菌，实现突变酶高效表达，用亲和层析分离纯化高纯度Ｄ－氨基酸氧化酶，包括下述步骤，１）突变Ｄ－氨基酸氧化酶基因，以质粒ｐＰＩＣ３．５Ｋ－ＤＡＡ Ｏ为模板，在ＤＡＡＯ编码序列的５’端和３’端导入连续编码６个组氨酸的Ｈｉｓｔａｇ序列，获突变基因；２）构建突变酶表达菌株，步骤１）的突变基因平端克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳＫ＋），经ＮｏｔⅠ和ＢａｍＨⅠ酶切后克隆到载体ｐ ＰＩＣ３．５Ｋ，得重组质粒ｐＰＩＣ３．５Ｋ－ｈｉｓＤＡＡＯ，所述重组质粒用ＳａｌⅠ线性化，电转化毕赤酵母宿主细胞，ＰＣＲ法、酶活力测定筛选阳性重组菌株Ｆｕｄａｎ０１１２，２００４年３月３日保藏于ＣＧＭＣＣ，保藏编号：ＣＧＭＣＣＮｏ．１１ ０３；３）发酵、培养、分离突变Ｄ－氨基酸氧化酶，步骤２）的菌株发酵、培养，超声破壁菌体、低温离心得上清作为粗酶液，再经Ｎｉ柱进行亲和层析，梯度洗脱。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周佩，冯美卿，史训龙，袁中一，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]