生产异黄酮苷元的方法技术

本发明专利技术涉及生产异黄酮的方法，特别是涉及从豆科植物中提取异黄酮葡糖苷并使用植物来源的糖苷水解酶由异黄酮葡糖苷转化生产异黄酮甙元的方法。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
专利技术的所属领域本专利技术涉及生产异黄酮的方法，特别是涉及从豆科植物中提取异黄酮葡糖苷并使用植物来源的糖苷键水解酶由异黄酮葡糖苷转化。专利技术的背景异黄酮是主要存在于豆科植物特别是大豆中的一类具有简单的二苯环结构的植物化学物质。在植物中，异黄酮主要以下列几种形式存在(1)苷元形式；(2)可通过β-葡糖苷键与糖部分(如葡萄糖)结合的糖苷配基形式；(3)糖苷形式+丙二酰部分；(4)糖苷形式+乙酰部分。其中葡糖苷形式是水溶性的并且是异黄酮在植物中便于运输和储存的主要存在形式。在植物细胞内，β-葡糖苷酶裂解糖部分，产生具有更强生物学活性但基本上不溶于水的糖苷配基即苷元形式的异黄酮。研究发现，异黄酮作为一类植物雌激素，具有调节和缓解与女性内源性雌激素水平降低或改变有关的症状(参见美国专利5,569,459、5,498,631、5,516528和WO99/48496)，另外，异黄酮还具有抗氧化(参见美国专利4,232122和4,366,082)、降低体内胆固醇含量(参见Anthony et al.，J.Nutr.，125Suppl.3S803S-804S，1995)，维持和改善骨组织生长(参见美国专利6,369,200)，以及维持正常血管功能(Circulation，901259，1994)等活性。特别是最近的研究还显示，植物材料如大豆中含有的异黄酮苷元(异黄酮糖苷配基)可以抑制乳腺癌和前列腺癌等人类肿瘤细胞的生长(Biochem.And Biophy.Reas.Commmun.1791，661-667，1991；The Prostate，22335-345，1993)。异黄酮苷元是具有不含糖部分的游离二苯环结构的分子，主要包括比异黄酮糖苷具有更强活性的染料木黄酮(Gen)、大豆苷元(Den)和大豆黄素。从作为药物和保健食品应用角度，异黄酮苷元的提取和制备已引起了人们的更大兴趣。将连接有糖苷基团的异黄酮结合物转化为不含糖基的异黄酮苷元的一般方法是已知的(例如参见美国专利5,827,682、5,851,792和6,146,668；日本专利申请22258,669、日本专利89-345164/47以及国际专利申请PCT/US/94/10699)。现有技术中，由天然存在的异黄酮糖苷或异黄酮结合物(即葡萄糖分子上连接有其他附加部分的异黄酮，例如6”-O-乙二酰染料木苷)转化成异黄酮苷元的方法包括一是首先于低pH下加热(80-100℃)处理大豆蛋白提取物，然后使之与能够裂解分子中β-1，4-糖苷键的水解酶接触。水解后，将不溶的植物材料与水相分离开，然后加入适当的有机溶剂，由此提取并分离得到所需的异黄酮苷元。所使用的水解酶可以是植物材料中天然存在的，或者是外加的。其中，外加的糖水解酶包括β-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶和β-木聚糖酶等。在利用植物材料内存在的天然酶活性的情况下，一般需要将植物材料(例如大豆粉)于45-55℃条件下加热几小时(参见日本专利89-345164/47)。但在仅仅利用内源酶的情况下，只能达到大约50％的转化率。第二种方法是，首先将磨碎的植物(大豆)材料与水混合一定时间(几天至几小时)，使天然糖苷形式的异黄酮充分溶解于水相中。从水相中分离不溶性材料后，再使用上述酶水解方法将水相中的异黄酮转化成其苷元形式，然后回收之。或者，亦可首先以离子交换树脂吸附法从水相混合物中选择性地除去苷元，然后使用水有机溶剂混合物从树脂柱上洗脱异黄酮，蒸发浓缩后使用酶促消化或加热/酸水解方法将异黄酮转化成其苷元形式(参见日本专利95-272884/36)。上述这些方法的均存在以下几个方面的缺点(1)需要多个处理步骤；(2)需进行加热和强酸或强碱处理；(3)异黄酮的产率较低；以及(4)所使用的水解酶的成本很高。因此，本领域有必要提供一种更为简便，适于大规模工业化生产应用，而且成本更低的。专利技术的目的本专利技术的一个目的是提供一种利用外源性糖苷键水解酶从豆科植物材料来源的异黄酮葡糖苷制备异黄酮苷元的方法，特征在于其中所说的糖苷键水解酶是植物来源的混合酶。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中所说的豆科植物材料选自豆科植物种子、发芽种子、胚芽或脱脂大豆粕。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中所说的豆科植物选自大豆和黑豆。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中所说的混合酶是具有β-1，4-糖苷键水解活性的苦杏仁苷酶和樱叶酶的混合物。根据本专利技术的一个优选实施方案，其中所说的混合酶的加入量约占底物重量的0.1-10％。专利技术的详细描述本专利技术涉及生产异黄酮的方法，特别是涉及从豆科植物中提取并使用植物来源的酶由异黄酮葡糖苷转化得到异黄酮苷元的方法。如前所述，天然状态下异黄酮在植物体内基本上是以异黄酮葡糖苷的形式存在的。在细胞内的生化功能部位，内源性β-葡糖苷酶裂解分子的糖部分，产生有更强生物学活性但基本上不溶于水的糖苷配基即苷元形式的异黄酮。根据本专利技术，本领域技术人员可以按照任何一种已知的方法由豆科植物特别是大豆或黑豆中分离天然存在的异黄酮葡糖苷和其结合物，然后利用植物特别是苦杏仁来源的β-1，4-糖苷键水解酶，并在植物材料(特别是豆科植物胚芽或发芽的豆科植物种子)本身的内源性酶的帮助下，以接近100％的转化效率将异黄酮糖苷转化成其苷元形式。可以使用多种不同的方法从植物材料中分离并纯化包括糖苷和苷元两种形式的异黄酮。例如，可以用水与有机溶剂的混合物(例如60％乙醇)提取干燥的植物材料；将提取物与不溶性植物材料分离开并除去有机溶剂；然后浓缩含水相即得到所需的异黄酮(国际专利申请WO99/23069)。或者，用水与有机溶剂的混合物(例如60％乙醇)提取预干燥的植物材料(例如红花草)；除去不溶性的植物材料和有机溶剂并用其他有机溶剂如石油醚提取水相；除去有机溶剂并干燥水相后以HPLC法分离得到含芳族发色基团的异黄酮(国际专利申请WO99/43335)。或者，首先用水与有机溶剂的混合物(例如60％乙醇)提取干燥并磨碎的新鲜植物材料；分离提取物并除去有机溶剂；再用有机溶剂如石油醚、己烷或乙酸乙酯提取水相；然后除去有机溶剂并干燥水相即得到所需的异黄酮组合物(国际专利申请WO99/48496)。或者，可以首先用pH值高于植物材料中蛋白质等电点的含水萃取剂提取含异黄酮和蛋白质的植物材料；然后分离含水提取物并在大约45-75℃和pH6-10条件下处理所说的提取物，以将异黄酮结合物转化成异黄酮葡糖苷(参见美国专利5,726,034和6,015,785)。总结上述这些方法，一个共同的特征是，在用有机溶剂提取异黄酮之前，最好首先用水或与水混溶的有机溶剂将(干燥的)植物材料浸渍足够长的时间，以期使植物材料自身所含有的糖苷键水解酶尽可能地释放出来，并在原位发挥作用，以将结合并不十分牢固的异黄酮-糖结合体分离开。其中所使用的水混溶性有机溶剂可以是含1-4个碳原子的醇(如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇)，以及乙二醇、丙二醇、丁二醇、乙酸乙酯和丙酮等。浸渍过程最好在大约25℃避光和惰性环境下完成，并且最好预先将被浸渍的植物材料磨碎。因此，为了从豆科植物材料中得到有足够高异黄酮(特别是异黄酮苷元)含量的提取物，可以首先用至少一种与水混溶的有机溶剂提取干燥的植物材料；分离除去不溶性的植物材料后，本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用外源性糖苷键水解酶从豆科植物材料来源的异黄酮葡糖苷制备异黄酮苷元的方法，特征在于其中所说的糖苷键水解酶是植物来源的混合酶。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴炳新，孙筱林，牛继江，褚新红，陈光芝，
申请(专利权)人：济南三株药业有限公司，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]