一种拟无枝酸菌及其生物转化洛伐他汀为无锡他汀的技术制造技术

一种拟无枝酸菌及其生物转化洛伐他汀为无锡他汀的技术，属于生物工程技术领域。本发明专利技术涉及一株由土壤中分离到并经鉴定为拟无枝酸菌属的菌株，其分类命名为拟无枝酸菌（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ　　ｓｐ．）ＳＴ２７１０，保藏编号为ＣＧＭＣＣ　　Ｎｏ．１１４９。本发明专利技术还涉及利用该菌株生物转化洛伐他汀（Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）为无锡他汀（Ｗｕｘｉｓｔａｔｉｎ）的技术，所涉及的一种转化产物命名为无锡他汀。所得转化产物Ⅰ和Ⅱ为同分异构体，比洛伐他汀的分子量多１６，表明菌株ＳＴ２７１０对洛伐他汀有羟基化作用。转化产物Ⅱ为新化合物，命名为无锡他汀；转化产物Ⅰ、Ⅱ或Ⅰ和Ⅱ的混合物，他们对ＨＭＧ－ＣｏＡ还原酶活性的抑制作用比洛伐他汀明显要强，为新药的开发提供一条可行的生物转化合成途径。

【技术实现步骤摘要】

一种拟无枝酸菌生物转化洛伐他汀为无锡他汀的技术，属于生物工程
本专利技术涉及一株由土壤中分离到并经鉴定为拟无枝酸菌属的菌株，定名为拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)ST2710。本专利技术还涉及利用所述菌株生物转化洛伐他汀(Lovastatin)为无锡他汀(Wuxistatin)的技术。
技术介绍
随着人们生活水平的提高，饮食结构的调整，现在高血脂和冠心病的病人数量不断提高，特别是发达国家，以美国为例，每年大约有1300-1400万成年人面临此病。因此心血管疾病是一类严重危害人类健康的疾病，在世界范围内其发病率和死亡率始终居高不下，接近世界人口总死亡的1/4，成为人类健康的头号大敌。在今天的世界上，心血管疾病比其他任何疾病杀死更多的人，并使千百万人致残。他汀类物质通过与3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶竞争性结合，抑制后者的活性，从而在调节血浆胆固醇水平中起重要功能，他汀类物质也可促进LDLR的合成，降低血浆中低密度脂蛋白(LDL)的水平，降低甘油三酯(TG)的水平。1978年，从土壤中分离到一株菌Aspergillus terreus，能产生洛伐他汀(lovastatin)，能明显降低血清中总胆固醇的含量和原发性高胆固醇血症病人的LDL-胆固醇，因其安全性好，在1987年获得FDA批准用于临床。微生物对洛伐他汀的转化是在1983年由日本学者首次提出，他们在进行美伐他汀转化成普伐他汀时，偶然发现Mucor hiemalis SANK 363672对洛伐他汀也具有转化作用。1990年，Merck公司的研究人员发现actinomycete MA 6474(ATCC53828)在适宜的条件下，对洛伐他汀的钠盐也具有转化作用，可生成羟甲基-洛伐他汀和8-酰基洛伐他汀的衍生物(辛伐他汀的衍生物)，且后者对HMG-CoA还原酶的抑制效果好于洛伐他汀，并申请了欧洲专利。在1997年Antonia Jekke发现Absidia coeruleu IDR705对洛伐他汀有转化作用，并且二者对HMG-CoA还原酶的抑制效果同洛伐他汀相似。在以上这些转化产物中，羟基化的洛伐他汀有以下三种 A为洛伐他汀，其余三种为转化产物到目前为止，对他汀类物质有转化作用的菌株主要为Nocardia sp.(MA6455)(ATCC 53695)；Nocardia autotrophica；Actinomycete(MA 6474)；Streptomyces carbophilus，Streptomyces sp.Y-110；Actinomadura sp.(ATCC55678)以及Absidia coeruleu(IDR 705)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种拟无枝酸菌生物转化洛伐他汀为无锡他汀的技术，通过微生物转化作用技术，将洛伐他汀转化为另一种他汀类物质，并通过发酵工程相关技术对转化确定最佳工艺条件，为新药的开发提供一条可行的合成途径。本专利技术的技术方案专利技术人从自然界采取的土样中分离得到一株菌ST2710对洛伐他汀具有转化作用。采用高氏合成1号琼脂培养基进行形态特征观察，采用国际链霉菌计划(ISP)和Waksman推荐的培养基进行培养特征观察；进行系列生理生化试验并对该菌的16S rDNA进行制备与测序，并将所测菌株ST2710的16S rDNA序列与美国国家生物信息中心(NCBI)核酸序列数据库中已有序列进行比对(Blastn)，菌株ST2710确定为Amycolatopsis属，并定名为拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)，保藏编号为CGMCC No.1149。菌株CGMCC No.1149生物转化洛伐他汀的工艺为 (1)转化培养种子培养基(g/L)KNO31，无水K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 0.5，FeSO4·7H2O 0.01，可溶性淀粉20，琼脂20，去离子水1000mL，pH 7.2-7.4。转化培养基(g/L)葡萄糖10，干酪素酸水解物1-3，牛肉膏1，玉米浆2-4，去离子水1000mL，pH 7.0。培养方法菌株ST2710先在种子培养基中进行1-2d预培养后，再以5％接种量接入转化培养基中再培养1-2d，之后加入洛伐他汀钠盐溶液，使洛伐他汀在培养基中浓度为0.01-0.05％，继续培养2-7d，得转化发酵液。(2)转化产物的初提将得到的发酵液经离心去掉菌体，用碱在搅拌下调pH到9.0-10，之后继续搅拌一段时间。再用酸调pH到2-3，然后加入乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯相，反复萃取三次，最终将乙酸乙酯相合并。乙酸乙酯相用无水Na2SO4进行干燥，之后旋转蒸发成油状物，用乙酸乙脂溶解，加入三氟乙酸进行酯化，在室温下搅拌15-25h，用0.5-1.5％的NaHCO3溶液进行洗涤，萃取得有机相，再浓缩得油状物。(3)转化产物的制备柱子的洗脱将初提液，按其中干物质的含量计，与硅胶按1∶1-2比例进行混合，除去有机溶剂，加于层析柱内，采用氯仿与甲醇体系分段进行洗脱，先用氯仿进行洗脱，通入氮气，使流速保持V＝0.5-1.5mL/min，用氯仿进行洗脱后，经薄层检测，发现没有斑点出现；再用氯仿∶甲醇(95∶5)洗脱时，通过薄层和HPLC分析，发现有洛伐他汀被洗脱下来，同时还有一些杂质；随后用氯仿∶甲醇(90∶10)进行洗脱，经检测没有转化产物被洗脱下来；然后用氯仿∶甲醇(85∶15)进行洗脱，发现有转化产物出现，但二者是同分异构体没有被分开，同时其它杂质也被洗脱下来；以后进行的几组洗脱，虽然有斑点出现，但不是转化产物。高效液相色谱制备将上述收集的含有转化产物的组分进行浓缩之后用高效液相色谱进行制备，得到两种转化产物I和II，HPLC分析纯度达95％以上。转化产物I和II的质量比约为6∶10。其中的转化产物II为一种新化合物，命名为无锡他汀(Wuxistatin)，经紫外光谱、质谱和核磁共振图谱分析，其结构式为 其中在转化培养时所加洛伐他汀钠盐溶液的配制，称取1g洛伐他汀，溶于15ml的二甲基甲酰胺中，然后再加入85ml 0.1mol/L NaOH溶液，微孔过滤除菌备用。在转化产物的初提时，采用三氟乙酸对转化产物进行内酯化，三氟乙酸的加入量为溶液体积的0.1-0.2％。在转化培养过程中，我们研究了一些金属离子对洛伐他汀转化率的影响，Mg2+对转化率有促进作用，而Zn2+、Cu2+、Mn2+对转化率有抑制作用。在转化培养基中，0.0625-0.250mg/ml浓度的Mg2+浓度对转化率有提高作用，转化率可以提高1.1-1.8倍。本专利技术的有益效果首次发现ST2710(Amycolatopsis sp.)对洛伐他汀有转化作用。从本实验室自行筛选于自然界并保藏的放线菌中得到对洛伐他汀有转化作用的菌株ST2710，通过形态特性、培养试验、生理生化试验，以及16S rDNA序列分析发现菌株ST2710属于Amycolatopsis属，初步将菌株ST2710定为Amycolatopsissp.。获得一种新的对HMG-CoA还原酶有较强抑制作用的洛伐他汀衍生物，通过微生物转化洛伐他汀，将转化产物进行提取、分离和纯化，并进行结构鉴定；结果发现其中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种拟无枝酸菌，其分类命名为拟无枝酸菌（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ　　ｓｐ．）ＳＴ２７１０，保藏编号为ＣＧＭＣＣ　　Ｎｏ．１１４９。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：诸葛健，方慧英，于海，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]