硫酸酯酶及其用途制造技术

本发明专利技术涉及一种新的得自放线菌（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）的烷基硫酸酯酶及其应用，特别涉及其在二级硫酸酯的酶促转化中的用途。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及来自于放线菌(actinomycetes)的新的硫酸酯酶及其用途，特别涉及其在二级硫酸酯的酶促转化中的用途。硫酸酯酶是催化硫酸酯水解为无机硫酸和相应醇的酶。硫酸酯的酶促水解按照如下一般反应模式进行已知大量的硫酸酯酶可以依据他们的优选底物被划分为烷基硫酸酯酶，芳香基硫酸酯酶和碳水化合物硫酸酯酶。在更高等的生物体中，硫酸酯酶特别介导糖脂，糖胺聚糖，或类固醇硫酸酯类的水解。另一方面，在细菌中，其在从环境中吸收硫和推测为细胞生长供应储能含硫化合物方面具有重要作用。描述的最好的一组硫酸酯酶是非常保守的芳香基硫酸酯酶，其可以接受芳香族的，特别是酚类的底物。然而，一些芳香基硫酸酯酶，例如那些从人类细胞中分离出来的，优选地转化碳水化合物硫酸酯。芳香基硫酸酯酶的特点是在酶的活化中心有一个丝氨酸半醛单位，即Cα-甲酰甘氨酸(Fglyc)单位，其可以通过翻译后修饰的半胱氨酸或丝氨酸残基形成。这个翻译后修饰对酶的生物化学功能是必需的。细菌芳香基硫酸酯酶属于所谓的“硫饥饿诱导的蛋白质”(sulfatestarvation-induced proteins，SSI蛋白质)，例如，其可以通过使用含有替代硫源如芳香硫酸，烷基硫化物，硫醚等的培养物形成。很少被描述的是烷基硫酸酯酶类，其催化一级和二级醇的有机硫酸酯的水解。更另人惊讶的是每年大量的烷基硫酸盐作为生活物品(如去垢剂)的组成物被释放到环境中并被微生物降解掉(Y.C.Hsu，Nature200，1091-1092(1963)；Williams，J.等，Appl.Microbiol.12，360-362(1964)；White，G.F.等，Environ.Pollut.Ser.A.37，1-11(1985))。Dodgson，K.S.等在Sulfatases of Microbial Origin，2卷，CRC Press公司，Boca Raton(1982)的一篇综述中首次描述了特异的烷基硫酸酯酶的存在。目前被最好描述的烷基硫酸酯酶来源于革兰氏阴性菌株假单胞菌(Pseudomonas)C12B(NCIMB 11753＝ATCC 43648)和土生丛毛单胞菌(Comamonas terrigena)(NCIMB 8193)(Dodgson，K.S.等，Sulfatasesof Microbial Origin，2卷，CRC Press公司，Boca Raton(1982))。假单胞菌C12B根据培养条件可以最多表达5个不同的烷基硫酸酯酶，其适于水解一级或二级烷基硫酸酯(Dodgson，K.S.等，Biochem.J.138，53-62(1974)；Bartholomew，B.等，Biochem.J.169，659-667(1978)；Cloves，J.M.等，Biochem.J.185，13-21(1980))。相反，土生丛毛单胞菌只有两个二级烷基硫酸酯酶(Fitzgerald，J.W.等，Biochem.J.149，477-480(1975)；Barrett，C.H.等，Biochem.J.，191，467-473(1980)；Matcham，G.W.J.等，Biochem.J.167，723-729(1977))。另外，目前可能证实在恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)FLA，阴沟气杆菌(Aerobacter cloacae)中也有烷基硫酸酯酶活性(Payne，W.J.等，Nature 214，623-624(1967))并且推测在假单胞菌B-2中也存在(Lijmbach，G.W.M.等，J.Microbiol.Serol.39，415(1973))。进而，可能在分离自活性悬浮液的微生物的混合培养物中检测到烷基硫酸酯酶活性(Vacium，L.等，Res.Roum.Biochim.2，149(1976))。目前，具有一级烷基硫酸酯酶活性的仅有的革兰氏阳性细菌株是蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)(Singh，K.L.等，World J.Microbiol.Biotechnol.14，777-779(1998))和棒状杆菌Bla(Coryneform sp.Bla)(Payne，W.J.等，Appl.Microbiol.13，698(1965))。目前，事实上只在个别情况下烷基硫酸酯酶可以被纯化均匀。到目前为止，很少了解它们的结构，底物特异性或它们的性质。由于这些原因，烷基硫酸酯酶目前没有被应用例如在有机合成中，尽管这些酶可能在对映选择性制备二级醇，例如消旋物的裂解中，是有用的工具。烷基硫酸酯酶的工业潜力因此根本很少被开发。由此出发，本专利技术的目标是提供新的烷基硫酸酯酶，其可以被应用，例如，作为裂解烷基硫酸酯的酶工具。然而，在水解二级烷基硫酸酯方面，大多数已知具有显著二级代谢并检测了烷基硫酸酯酶的原核和真核微生物不表现活性(表1)。另一方面发现，令人惊讶的是，与其它革兰氏阳性细菌不同，在放线菌，特别是红球菌(rhodococci)中表达二级烷基硫酸酯酶。此外，这些二级烷基硫酸酯酶可以被纯化均匀，而且酶不丧失活性。本专利技术提供了得自放线菌，优选得自红球菌属的二级烷基硫酸酯酶。表1在革兰氏阳性细菌和真菌中用消旋-2-辛基硫酸酯作为检测底物搜索二级烷基硫酸酯酶的结果。 n.d.＝没有数据n.c.＝没有转化a相对分子量b((+)/)有酶活性的二级烷基硫酸酯酶可以考虑采取以下纯化步骤从特殊的放线菌株中分离a)用递减的无硫酸盐盐梯度通过苯基琼脂糖柱进行无细胞的裂解物的粗纯化，b)将所得的具有烷基硫酸酯酶活性的组分在离子交换树脂，优选阴离子交换树脂上进一步纯化，c)将所述通过离子交换层析获得的具有烷基硫酸酯酶活性的组分通过Blue琼脂糖柱，并且d)将所得的具有烷基硫酸酯酶活性组分中的酶通过Superdex200柱纯化均匀。在进行上述步骤时，预先用DEAE，TEAE或Ecteola纤维素或用DEAE葡聚糖凝胶A-25处理无细胞裂解物对除去非肽组成部分是有利的。二级烷基硫酸酯酶因而结合到载体上并用含盐缓冲液从那里分离以进一步纯化。一个已证明可成功的特别是从红球菌中分离二级烷基硫酸酯酶的纯化过程包含以下步骤a)在批量法(a batch process)中用DEAE纤维素处理放线菌菌株的细胞裂解物以除去类胡萝卜素，脂类等，b)用10mM Tris/HCl和0.5M NaCl的溶液洗脱酶，c)在洗脱液中加入NaCl至终浓度为4M NaCl，所得溶液用已经用含有4M NaCl，pH7.5的10mM Tris/HCl缓冲液(B缓冲液)平衡的苯基琼脂糖柱通过柱层析纯化，逐步用4M到0M梯度的NaCl来洗脱酶。为进一步纯化，继续d)以pH7.5，10mM Tris/HCl缓冲液对酶活性组分进行透析，然后e)用Q6柱(BioRad)进行离子交换层析，该柱用pH7.5，10mMTris/HCl缓冲液(A缓冲液)平衡，0M到1M梯度的NaCl用来洗脱。梯度可以通过，例如，逐步加入A缓冲液和C缓冲液(10mMTris/HCl，pH7.5，1M NaCl)的缓冲液混合液来获得。进一步的纯化是f)将酶活性组分通过Blue琼脂糖柱(Pharmacia)，酶活性组分置于本文档来自技高网...

【技术保护点】
得自放线菌（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）的二级烷基硫酸酯酶。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：库尔特法贝尔，马泰亚波戈雷韦，托马斯里尔迈尔，
申请(专利权)人：德古萨股份公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]