公开了一种功能活性的透明质素合酶，该合酶与相应功能活性的天然透明质素合酶相比在其中具有至少一个修饰的氨基酸残基，从而该功能活性的透明质素合酶与相应功能活性的天然透明质素合酶相比具有改变的酶活性。也公开了利用重组宿主细胞生产透明质酸的方法，该宿主细胞具有编码酶活性改变的功能活性透明质素合酶的表达构建体。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
对相关申请的交叉引用根据35 U.S.C.119(e)，本申请要求2001年12月3日提交的美国专利申请号60/336,105的优先权和利益，题目为“透明质酸合酶的新动力学性质”，其全部内容在此处明确地引入作为参考。本申请也要求2001年12月11日提交的美国专利申请号10/011,771的惯例优先权并是其美国继续申请，题目为“透明质素合酶基因及其用途”，其全部内容在此处明确地引入作为参考。关于美国联邦政府赞助的研究或开发的声明本申请部分由美国国家健康研究所(National Institute of Health)的拨款(GM35978)支持。美国政府依照该资金而在本申请中且对本申请拥有某些权利。
技术介绍
1.专利
本专利技术涉及具有编码酶活性透明质酸盐合酶(HAS)的编码区的核酸区段，并涉及该核酸区段在制备重组细胞中的应用，该重组细胞生产透明质酸盐合酶及其透明质酸产物。透明质酸盐也已知为透明质酸或透明质素。更具体地，但绝不是为了限制，在此处公开和申请专利的核酸区段与天然核酸区段相比具有至少一个突变，从而该至少一个突变导致对结果所得的酶的动力学或酶活性的改变/修饰。2.相关技术简述链球菌感染的发生是全球主要的健康和经济问题，特别是在发展中国家。原因之一是由于链球菌(Streptococcal)细菌可进行由身体的吞噬细胞即巨噬细胞和多形核细胞(PMNs)不可探测的生长的能力。这些细胞负责识别及吞入外源微生物。细菌逃避监视的一个有效途径是通过将自身用多糖被膜进行包被，如透明质酸(HA)被膜。HA的结构在原核生物和真核生物中是相同的。由于HA通常是非免疫原性的，所以被囊化的细菌不引起免疫反应，因此不被靶向破坏。此外，该被膜在体外给PMNs施加了抗吞噬的作用，且防止链球菌属(Streptococcus)与巨噬细胞的附着。正由于此，在A组和C组链球菌属中，HA被膜是天然和实验室感染中主要的病毒因子。A组链球菌属负责多种人类疾病，包括咽炎、脓疱疮、深组织感染、风湿热和毒性休克样综合症。C组类马链球菌(Streptococcus equisimilis)负责骨髓炎、咽炎、脑脓肿和肺炎。就结构而言，HA是高分子量重复二糖单元的线性多糖，该二糖单元由N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和葡糖醛酸(GlcUA)组成。HA分子中重复二糖的数目可超过30,000，Mr＞107。HA是唯一由哺乳动物和细菌细胞两者合成的糖胺聚糖，该细菌细胞特别为A和C组链球菌和A型多杀性巴斯德氏杆菌(Pasteurella multocida)。这些菌株生产分泌到培养基中的HA以及HA被膜。这些细菌合成HA的机制具有广泛的医学重要性，这是因为HA被膜的生产是细菌用于逃避免疫系统监视的非常有效和聪明的途径。此外，用HA包被的有机或无机分子具有使得其能够逃脱宿主免疫系统探测和破坏的性质。HA是由哺乳动物和细菌细胞用透明质酸盐合酶进行合成的，该酶定位于质膜上。人们相信HA在这些生物中的合成是多步骤的过程。起始阶段涉及起始前体、UDP-GlcNAc或UDP-GlcUA的结合。随后进行延伸，包括向生长的寡糖链交错添加两种糖。生长的多聚体从细胞的质膜区域伸出并伸到细胞外空间。HA已在脊椎动物中的几乎每一种组织中得到了鉴定，且已在多种临床应用中获得了广泛的应用，最引人注目的和适当的是作为关节内基质补加物和在眼外科中。科学文献也显示从最初认为HA主要是少数结缔组织的基质和某些细菌菌株的被膜中的被动结构成分的理解转变为对于该遍在大分子动态地参与许多生物学过程的认识从在胚胎发生过程中调节细胞迁移和分化到细胞外基质组织和代谢的调节到在转移、伤口愈合和炎症的复杂过程中的重要作用。进一步地，渐渐明白的是HA是高度代谢活性的，且细胞非常关注其合成和代谢的过程。例如，组织中HA的半衰期在软骨中为1～3周，在表皮中为＜1天。HA也用于许多技术应用(如润滑化合物)、化妆品和神经药物(neutraceutical)中。现在明白单独一个蛋白质利用两种糖底物合成HA，即HA合酶是具有双重催化性质的单一的酶。HA合酶的缩写HAS已得到广泛支持以指代该类酶。Markovitz(1959)等人成功地描述了来自化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的HAS活性的特征，并发现了酶的膜定位及其对糖核苷酸前体和Mg2+的需要。Prehm(1983)发现由B6细胞制备的延伸的HA被添加到培养基中的透明质酸酶消化，并提出HAS存在于质膜上。Philipson和Schwartz(1984)也显示小鼠少突胶质细胞瘤细胞中HAS活性与质膜标记共分离。随着糖胺聚糖合成的进行，HAS装配了高Mr的HA，该HA同时从膜伸出到细胞外空间(或者在细菌的情况中制备细胞被膜)。该合成模式在大分子中是独特的，这是因为核酸、蛋白质和脂质是在细胞核、内质网/高尔基体、胞质或线粒体中合成的。生长的链向细胞外空间的伸出也使得能够进行不受拘束的多聚体的生长，因此实现了HA异常大的大小，而合成局限于高尔基体或高尔基体后区室中限制了形成的多聚体的总量或长度。被限制的腔中高浓度的HA也可形成高粘度的环境，该环境对于其他细胞器的功能可能是有害的。已有几个研究试图从形成HA被膜覆盖物的链球菌菌株以及从真核细胞中溶解、鉴定及纯化HAS。尽管对链球菌和鼠少突胶质细胞瘤的酶成功地用去污剂进行了溶解并进行了研究，但纯化活性HAS以进一步研究或进行分子克隆的努力在数十年中仍然是不成功的。Prehm和Mausolf(1986)用高碘酸盐氧化的UDP-GlcUA或UDP-GlcNAc以对链球菌膜中与HAS共纯化的～52kDa的蛋白质进行亲和标记。这导致一个报道宣称已克隆了C组链球菌HAS，不幸的是该报道是错误的。该研究未能证明活性合酶的表达，且可能事实上克隆了一个肽转运蛋白。Triscott和van de Rijn(1986)用毛地黄皂苷使活性形式的来自链球菌膜的HAS溶解。Van de Rijn和Drake(1992)用5-叠氮-UDP-GlcUA对42、33和27kDa的3种链球菌膜蛋白质进行了选择性放射性标记，并认为33-kDa的蛋白质是HAS。然而如在后文所示的，HAS事实上为42-kDa的蛋白质。尽管有这些努力，但在理解HA合成的调节和机制中的进展基本上是停滞的，这是因为没有HAS mRNA或HAS蛋白质的分子探针。1993年当DeAngelis等人(1993a和1993b)报道编码蛋白质HasA的A组链球菌基因的分子克隆或特征时发生了重大的突破。该基因已知为细菌HA合成所需的操纵子的部分，尽管现在称为spHAS(化脓链球菌的HAS)的该蛋白质的功能是未知的。随后证明spHAS负责HA延伸(DeAngelis和Weigel，1994)且是第一个鉴定、克隆及成功表达的糖胺聚糖合酶。化脓链球菌的HA合成操纵子编码2个其他的蛋白质。HasB是UDP-葡萄糖脱氢酶，该酶是UDP-葡萄糖转变为HA合成的底物之一UDP-GlcUA所必需的。HasC是UDP-葡萄糖焦磷酸化酶，该酶是葡萄糖1-磷酸与UTP转变为UDP-葡萄糖所必需的。hasA和hasB基因向无被膜的链球菌菌株或粪肠球菌(Enteroccus faecalis)中的共本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种功能活性透明质素合酶，该合酶与相应功能活性天然透明质素合酶相比在其中具有至少一个修饰的氨基酸残基。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：PH威格尔，K库马里，
申请(专利权)人：俄克拉何马大学董理会，
类型：发明
国别省市：US[]
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