编码表位结合型β2m且感染哺乳动物细胞的病毒载体及其应用制造技术

本发明专利技术构建了编码表位结合型β２ｍ的感染哺乳动物细胞的病毒载体，并成功地在哺乳动物细胞中大量表达该表位结合型β２ｍ。本发明专利技术提供编码表位结合型β２ｍ微球蛋白（β２ｍ）的感染哺乳动物细胞的病毒载体及其用途。另外，本发明专利技术提供使用该载体的Ⅰ类ＭＨＣ／肽复合体的制备方法。特别是７四聚体化的Ⅰ类ＭＨＣ／肽复合体可以用于检测表位特异性ＣＤ８阳性Ｔ细胞。本发明专利技术还提供导入了该载体的细胞。另外，本发明专利技术提供。添加了用本发明专利技术载体生产的表位结合型β２ｍ的靶细胞。这些细胞被抗原特异性细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）识别。本发明专利技术载体和通过表达本发明专利技术载体获得的多肽感染性疾病或癌症的免疫治疗，或抗原特异性ＣＴＬ的检测和定量。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及编码表位结合β2m的感染哺乳动物细胞的病毒载体及其利用。
技术介绍
MHC(主要组织相容性复合体)I类分子是由重链(HC)和β2微球蛋白(β2m)组成的异二聚体，存在于体内几乎全部细胞的细胞膜表面。I类MHC分子中由重链构成的肽容纳沟能容纳约10个氨基酸的肽。该I类MHC/肽复合体被起细胞免疫作用的细胞毒性T细胞(CTL)上的T细胞受体(TCR)识别，因此在I类MHC分子上呈递的肽称为“表位”(抗原决定簇)。来自细胞质内产生的自身抗原、或病毒抗原、肿瘤抗原等的肽片段通过粗面内质网上的TAP(与抗原加工相关的转运体)运到粗面内质网，在那与I类MHC重链和β2m形成稳定的I类MHC/肽复合体。β2-微球蛋白分子起维持I类MHC立体结构的稳定性和将H链转运到细胞表面的作用(TasukuHonjo和Takeshi Watanabe(ed.)，“Immune SystemRecognition，differentiation，and proliferation”，The Molecular Biology Society of Japan(ed.)，Maruzen Co.，Ltd.，Tokyop117-118)。已知没有结合肽的I类MHC分子在37℃的培养条件下非常不稳定。表位是被I类MHC分子呈递的肽，它是诱导对某些抗原的特异性细胞免疫的非常重要的分子。目前正在尝试开发针对以HIV为代表的病毒感染或癌症的免疫治疗的肽疫苗。但是来自大多数病毒抗原或肿瘤抗原的主要表位的肽与I类MHC分子的结合很弱，当仅用肽作为疫苗时，因其稳定性低，也不能期待有一般的效果。1998年采用了进行过氨基酸取代以在不损害抗原性的条件下提高与I类MHC分子结合的活性的人工表位。但这种稳定性、抗原性优良的表位的鉴定和开发非常烦杂和困难。另一方面，已知β2m增加I类MHC分子上肽的稳定性的现象，目前正在开发能利用该β2m的辅助效果的系统。近年来，正在尝试表达I类MHC/肽复合体，其中已将表位肽与MHC I和II类分子或β2m融合(Uger，R.A.和Barber，B.H.，J.Immunol.1601598-1605(1998)；White，J.等，J.Immunol.1622671-2676(1999)；Kang，X.等，Cancer Res.57202-205(1997)；Uger，R.A.等，J.Immunol.1626024-6028(1999)；USP No.5,869,270)。有报告指出，那些利用接头使表位肽序列融合到β2m的N末端(表位结合β2m，也表示为“e/β2m”)而形成的复合体，与单独的肽相比，稳定性以及CTL识别都增加，特别是用与I类MHC分子结合力弱的表位构建的那些复合体。但是，这些报告中主要使用大肠杆菌表达载体，尚不知道采用感染哺乳动物细胞的病毒载体的例子。如果使外源蛋白在大肠杆菌中大量表达，则经常发现形成包涵体(inclusion body)而不溶的情况。不溶性蛋白可以用尿素等变性剂溶解，然后进行蛋白质的重折叠，但并不是所有的蛋白质都可溶解，操作也烦杂。另外，还担心混入来自大肠杆菌的杂质。另外，利用哺乳动物表达质粒进行基因导入的效果差，不能期望有充分的表达。使用哺乳动物表达质粒的另一缺点是，这种质粒必须转移到核中进行表达，因此它们只能在核膜已消失的分裂期细胞中表达。I类MHC/肽复合体也可以用于抗原特异性CTL的分析。个体内抗原特异性CTL的频率定量以往可以采用所谓有限稀释分析的方法，但必需长期进行体外培养，并且灵敏度差，因此1996年开发了简便并且灵敏度好的“I类MHC/肽四聚复合体(四聚体)(Altman，J.D等，Science 27494-96(1996))。它是利用生物素-抗生物素蛋白的结合将I类MHC/肽复合体四聚体化，然后添加荧光标记所得的物质，它用于FACS分析。该方法可以直接利用从个体分离的外周血单核细胞进行测定，因此简便并且直接反映个体内的频率，并且具有很高的灵敏度和特异性(Wilson，J.D.K.等，J.Exp.Med.188785-790(1998)；Kuroda，M.J.等，J.Exp.Med.1871373-1381(1998))。现在正如下制备包含人I类MHC分子的I类MHC/肽复合体在大肠杆菌中使重链(HC)和β2m蛋白分别表达，纯化，然后将它们与合成肽进行体外折叠。相反，对于小鼠I类MHC分子，有报告指出，采用杆状病毒载体制备来自昆虫细胞的I类MHC/肽复合体(White，J.等，J.Immunol.1622671-2676(1999))。在该系统中，通过用分别表达I类MHC重链和表位结合β2m的杆状病毒共感染，在细胞内制备I类MHC/肽复合体。但是，尚不知采用感染哺乳动物细胞的病毒载体的例子。杆状病毒载体是表达昆虫细胞(例如Sf9细胞)中位于有效启动子下游的外源基因的系统(特表平6-502990)，因此不能利用来自哺乳类的细胞。另外，虽然Punnonen等已经公开了用于DNA改组的基因疫苗载体(Punnonen，J.等，Genetic Vaccine Vector Engineering，USP专利申请No.20010006950)，但尚不知道编码表位结合型β2m的感染哺乳动物细胞的病毒载体。
技术实现思路
本专利技术提供编码表位结合β2m的哺乳动物细胞感染性细胞病毒载体及其应用。为了建立在哺乳动物细胞中大量表达表位结合型β2m和I类MHC/肽复合体的系统，本专利技术人尝试构建采用感染哺乳动物细胞的病毒载体的表达系统。为了实现此目的，本专利技术人用可以感染众多哺乳动物种类并且可以极高水平地表达导入基因的重组仙台病毒(rSeV)，构建了I类MHC/肽复合体和表位结合型β2m的SeV表达系统。本专利技术人以来自HIV-1Nef和Env蛋白的表位为例，构建了表达表位结合型β2m的SeV载体，并将其导入哺乳动物，以分泌型蛋白质的形式成功地回收了大量表位结合型β2m。发现回收得到的表位结合型β2m与细胞表面上的I类MHC重链结合，形成I类MHC/肽复合体，可以高效地将抗原呈递给CTL。由此表明，用动物感染性病毒载体制备的表位结合型β2m可以用作蛋白制剂。如果回收、纯化由载体导入细胞产生的表位结合型β2m，则可以得到临床上有用的抗原特异性细胞免疫诱导剂。另外，本专利技术人构建了表达I类MHC重链的SeV载体，将其与表达表位结合型β2m的SeV载体一起共感染哺乳动物细胞，回收并纯化I类MHC/肽复合体。进一步地，用SeV载体表达在缺失I类MHC重链膜结合区域的分泌型I类MHC重链上添加生物素化基质肽的分子，将所得的I类MHC/肽复合体生物素化后，使RPE标记的抗生物素蛋白结合上述复合体，由此制备I类MHC/肽四聚体。该I类MHC/肽四聚体适合用于CTL的检测和定量。该四聚体由于来自动物细胞，因此添加了糖链，其灵敏度有望高于来自大肠杆菌的四聚体。我们发现，用表达HLA-A*2402的SeV载体和表达β2m(其与HIV-1 Nef蛋白的表位结合)的SeV载体进行共感染，与脉冲给与来自HIV-1Nef蛋白的合成表位肽相比，能使细胞被抗原特异性CTL等效或更高效地识别。另外，检测从SeV载体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种感染哺乳动物细胞的病毒载体，其以可表达的方式编码表位结合型β２ｍ。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：岩本爱吉，立川爱，
申请(专利权)人：株式会社载体研究所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]