新的肌醇六磷酸酶和制造这些新肌醇六磷酸酶的方法技术

本发明专利技术涉及新的肌醇六磷酸酶，尤其是真菌来源，同时涉及它们各自的产生方法。本发明专利技术更特定涉及获得自青霉属真菌的新肌醇六磷酸酶，尤其是青霉属ＣＢＳ１０９８９９菌株，也涉及编码这些肌醇六磷酸酶的多核苷酸。发明专利技术同样涉及含这些多核苷酸的载体、在组织中表达所述肌醇六磷酸酶的转化的宿主生物。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及新的肌醇六磷酸酶，尤其是真菌来源，也涉及它们各自的制造方法。本专利技术更特定涉及获得自青霉属真菌的新肌醇六磷酸酶，尤其是青霉属CBS109899菌株，也涉及编码这些肌醇六磷酸酶的多核苷酸。专利技术还涉及含这些多核苷酸的载体、在组织中表达所述肌醇六磷酸酶的转化的宿主生物。本专利技术的肌醇六磷酸酶特别适合用于动物营养物的饲养组合物。此适当性与它们的性质相关，尤其是它们在温度和pH条件下的活性，这些条件对应于制备所述组合物的条件以及动物消化系统中所遇到的条件。磷是对于所有生物体生命必要的元素。它特别对于农场动物饲者非常重要，用于确定他们的动物消化足够量以最优化它们的生长和发育。大部分农场动物用以植物为基础的饲养组合物喂养。这些植物包含大量磷酸盐，它们将磷酸盐以贮藏化合物形式肌醇六磷酸保存在它们的组织中。肌醇六磷酸平均包含植物中存在的50％到70％的磷。肌醇六磷酸自然转移且其所含磷酸盐在大部分农场动物中释放，尤其是反刍动物。然而，肌醇六磷酸不被单胃动物代谢，如猪和家禽。因此在这些动物中，它们食物摄取中所含的肌醇六磷酸随着排泄物释放，饲者需要用无机磷酸盐补充所述摄入，从而使他的动物消化足够量磷。此策略造成饲者额外的花费且非吸收的肌醇六磷酸释放到环境中产生污染。此污染在饲养密集区域增加更快。同样已知肌醇六磷酸是食物摄入中所含重要营养成分的螯合剂，例如镁、钙、锌或铁。此性质导致食物摄入的营养质量下降，给予肌醇六磷酸抗营养剂的性质。为对应于多种与单胃动物缺乏肌醇六磷酸吸收相关的缺点，考虑将酶肌醇六磷酸酶导入这些家畜动物的食物摄入中。肌醇六磷酸酶水解肌醇六磷酸，释放肌醇和无机磷酸盐。肌醇六磷酸酶和编码这些肌醇六磷酸酶的基因从许多生物中体被分离。肌醇六磷酸酶主要从真菌中分离(Howsor和Davis，1983，Enzyme Microb.Technol.5，377-382；Wyss等，1999，Appli.Environ.Microbiol.，65(2)，359-366)。在这些产生肌醇六磷酸酶的真菌中，提到的真菌有曲霉属，尤其是A.ficcum(Ullah和Gibson，1987，Preparative Biochemistry 17(1)，63-91；Ullah和Dischinger，1993，Biochem.Biophys.Res.Commun.，192(2)，747-753)、土曲霉(A.terreus)(Mitchell等，1997，Microbiology，143(第1部分)，245-252)、黑曲霉(A.niger)(Dvorakova等，1997，Folia Microbiol(Praha)，42(4)，349-352)、烟曲霉(A.fumigatus)(Pasamontes等，1997，Appli.Environ.Microbiol.，63(5)，1696-1700)；青霉属，尤其是P.caseicolum；Myceliophthora，尤其是M.thermophila(Mitchell等，1997，Microbiology，143(第1部分)，245-252；Talaromyces，尤其是嗜热篮霉菌(T.thermophila)，脉孢菌属，尤其是粗糙脉孢菌(N.crass)和好食脉孢菌(N.sitophila)；高温霉菌属(Therrnomyce)，尤其是T.Lanuginosus(Berka等，1998，Appli.Environ.Microbiol.64(11)，4423-4427)；或红曲霉属，尤其是M.anka。肌醇六磷酸酶也在细菌中发现。作为例子，提到的细菌有芽孢杆菌属，尤其是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(Powar和Jagannathan，1982，J.Bacteriol.151(3)，102-1108；Shimizu，1992，Biosci.Biotech.Biochem.56(8)，1266-1269；Keruvo等，1998，Appli.Environ.Microbiol.64(6)，2079-2085)；假单胞菌属(Cosgrove，1970，Austral.J.Biol.Sci.23，1207-1220)；埃希氏菌属，尤其是大肠杆菌(E.coli)(Golovan等，2000，Can.J.Microbiol.46，59-71)；肠杆菌属(yoon等，1996，Enzyme and microbial.Technol.；18，449-454)或链霉菌属。酵母肌醇六磷酸酶也被分离(Dvorakova，1998，Folia Microbiol.43(4)，323-338)，如酵母Schwaniiomyces occidentalis和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。最后，肌醇六磷酸酶在植物中发现，尤其是大豆(Ullah和Gibson，1988，Arch.Biochem.Biophys.，260(2)，514-20)、玉米(Maugenest等，1997，Biochem J.，322(第2部分)，511-7；Maugenest等，1999，Plant Mol.Biol.，39(3)，503-14)或拟南芥(Arabidopsis)(Mullaney和Ullah，1998，Biochem.Biophys.Res.Commun.，251(1)，252-5)。能确定肌醇六磷酸酶特征的性质包括关于肌醇六磷酸的米氏常数(Km)、活性的最适pH和最适温度以及在特定pHs和温度的活性的稳定性。涉及肌醇六磷酸酶结构的数据也可使用，如分子量(MW)、等电点(pI)或肽序列。为能在动物营养物中使用，肌醇六磷酸酶的性质必须与用于此营养的饲料加工过程相容。特定的是，所用肌醇六磷酸酶的活性在制备这些饲料方法的温度和pH条件以及消化这些饲料的动物消化道中存在的条件下，必须维持且如果可能需为最佳。这些限制导致主要搜寻的肌醇六磷酸酶所具有的活性能抵挡高温条件如制备饲料组合物方法中所用条件，抵挡酸性pH条件如家畜动物消化道中存在的条件。为符合这些标准，在生物体中寻找肌醇六磷酸酶，尤其是微生物，其生长的环境中温度和pH条件与这些标准对应。此策略能分离抵挡高温的肌醇六磷酸酶，例如专利申请WO 97/35016或EP 0 684 313所述，也分离具低Km的肌醇六磷酸酶，例如专利申请EP 0 960 934所述。另一种策略是通过定点突变来人工修饰已知肌醇六磷酸酶序列以赋予其优势性质。此策略特定描述于专利申请WO 99/48380、EP 0 897 985和EP 0897 010。附图简述附图说明图1青霉属CBS 109899的肌醇六磷酸酶活性作为pH的函数。100％相对活性的值对应于特定pH的肌醇六磷酸酶最佳活性。图2青霉属CBS 109899的肌醇六磷酸酶活性作为温度的函数。100％相对活性的值对应于特定温度的肌醇六磷酸酶最佳活性。概述本专利技术涉及编码肌醇六磷酸酶的分离的多核苷酸，肌醇六磷酸酶由序列标识符SEQ ID NO3描述。此肌醇六磷酸酶和编码它的多核苷酸也来源自青霉属的真菌菌株，尤其是青霉属CBS 109899菌株。根据本专利技术，术语“多核苷酸”所指核酸分子包括本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种编码肌醇六磷酸酶的分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸选自：（ａ）编码序列标识符ＳＥＱＩＤＮＯ：３所示肌醇六磷酸酶的分离的多核苷酸（ｂ）与（ａ）所述的多核苷酸杂交的分离的多核苷酸（ｃ）与（ａ）所述的多核苷酸同源的分离的多核苷酸（ｄ）（ａ）、（ｂ）或（ｃ）所述多核苷酸的片段。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：O泰斯特尼尔，R宝尔曼，J皮拉德，D索尼尔，O诺尔，F牟苏，
申请(专利权)人：埃迪塞欧法国联合股份有限公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]