一种粗酶制剂及其生物转化制备香草醛的方法技术

一种粗酶制剂，含有大豆脂氧合酶，其特征在于用作丁香酚、异丁香酚转化为香草醛的生物催化剂。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
所属领域本专利技术涉及一种新的由植物提取的含脂氧合酶(Lipoxygenase)的粗酶制剂，及用其转化丁香酚或异丁香酚制备香草醛的方法。
技术介绍
香草醛(Vanillin)，又名香兰素，4-羟基-3-甲氧基苯甲醛(3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde)。分子式C8H8O3，分子量152.15。香草醛是食品、饮料等工业中应用最广泛的香料之一，还可作为保鲜剂及医药等工业的原料，需求量很大。香草醛目前主要由化学方法制备，但用化学合成法制得的香草醛不是天然香料。天然香草醛可以从香子兰的花荚中提取，但用植物组织提取的方法生产的天然香草醛量少而价高，不能满足日益增长的需求，从而促使研究人员去寻找生产天然香草醛的替代方法。随着世界各国对食品安全越来越重视，对天然香草醛的需求越来越大。天然香料是指由动植物材料经物理(包括蒸馏、溶剂萃取)方法、酶法或微生物方法得到的，可通过传统的食品加工方法(包括干燥、焙烤、发酵)加工后用于人类消费的物质。根据欧洲和美国立法，利用动植物资源通过物理方法、酶法或微生物法得到的物质才能称为天然物质(Muheim Andrea.US6,235,507.2001)。用生物法生产的香草醛，属天然产品，可以生物降解，符合消费者追求天然产品的消费心理。因此，利用生物转化技术生产生物香兰素，是一种有效的、很有前途的替代方法。用生物转化法生产生物香草醛的研究已经有十余年的历史，研究中采用了多种生物材料，包括真菌(Laurence Lesage Meessen et al.US 05866380.1999；US 06162637.2000)、细菌(Rabenhorst Jurgen and Hopp Rudolf.US6133003.2000)、放线菌(Audrs & More.WO 9634971.1996；Rabenhorst & Hopp.EP0761817.1997；Muller.EP 0885968.1998)基因工程菌(Overhage J，et al.Journal of Biotechnology.2000)、植物细胞(Podstolski A and Havkin-FrenkelD.WO 9903975.1999)及提取得到的酶(Frost JW.WO 0017319.2000)，研究了各种微生物，植物细胞内合成和降解香草醛的代谢途径，研究者在细胞、酶学、基因水平上进行了广泛的研究，并取得了很多研究成果。随着研究的深入，不少研究者开始致力于实现生物香草醛的工业化生产，并且已有成功的例子，如法国Laurence Lesage-meessen(Lesage-Meessen，L.，et al.J.Biotechnol，1996)研究的利用阿魏酸作为底物的二步法，先用黑曲霉(Aspergillus niger)将阿魏酸转化为香草酸，再用朱红密孔菌(Pycnporus cinnabarnus)或黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)将香草酸还原成香草醛，在发酵培养中添加大豆磷脂、盐酸硫胺素(VB1)等促生长剂，6-7d，香草醛的浓度达到1，575mg/L。本专利技术者的研究小组也在这方面取得了成功(孙志浩.CN 1421523A.2002)。在研究起始原料制备天然香草醛的新方法的过程中，我们发现，由于阿魏酸的价格较高，因此用这种方法生产的香草醛价格也比较高，而丁香酚、异丁香酚可在工业规模上从丁香油中提取，价格低廉，容易得到。我们也注意到，近10年前也已有一些用脂氧合酶转化丁香酚或异丁香酚进行生物转化的研究(Markus PaulHenry.EP 0542348A2.1993；Mane J and Zucca J.WO 9402621.1994)。在过去的十年里报道了许多用微生物法或酶法生产香草醛的方法，一般都是通过微生物或酶将合适的前体转化为香草醛。可利用的前体有阿魏酸、丁香酚、异丁香酚、姜黄素等，转化率通常很低。特别是在微生物代谢系统中，不易得到高产量的香草醛，主要原因是由于香草醛具有细胞毒性，其浓度超过1g/L就会阻止微生物生长，另外，由于在微生物系统中存在多种代谢途径，通常发现转化液中只有香草醇和香草酸而没有香草醛积累。利用酶可以避免香草醛的毒性(Markus.EP0,542,348A2)。1993年，Markus(EP 0542348A2)报道了用Sigma试剂脂氧合酶(Sigma-L8383)，以异丁香酚和丁香酚为底物酶法制备香草醛的过程，50ml规模，4h，香草醛浓度达22.8g/L；在3L规模的放大试验中，120h，香草醛浓度7.3g/L；并试验了土豆，大豆粉提取液来代替昂贵的脂氧化酶进行转化，香草醛产量仅0.0189g/L，几乎得不到目的产物。1994年，Mane和Zucca(WO 9402621)报道Sigma试剂脂氧合酶在20ml规模上添加活性炭，3d，转化异丁香酚得到香草醛的最高浓度达28.5g/L。1999年，Mane和Zucca(WO 9622381)又报道了他们的进一步研究结果添加原卟啉IX、FeCl2或血红素，3d，20ml规模，香草醛最高浓度为5.29g/L。可能是由于试剂酶太贵，无实用价值，因此一般认为利用脂氧合酶从经济角度分析是不合算的(Muheim Andrea.US6,235,507.2001)。近十年来并未见到深入研究与进一步开发的报道。脂氧合酶(Lipoxygenase，简称Lox)是一种二加氧合酶(Dioxygenase)。分子量范围一般在90,000-100,000之间。Lox在自然界中广泛存在，植物、动物、藻类、面包酵母、真菌以及氰细菌中均发现。技术方案本专利技术的目的是提供一种能有效转化异丁香酚和丁香酚为香草醛的新的粗酶制剂，并提供一种新的生物转化反应生成香草醛的方法。本专利技术的粗酶制剂，含有大豆脂氧合酶，其特征在于用作丁香酚、异丁香酚转化为香草醛的生物催化剂。所述粗酶制剂的制备方法，包括以下步骤(1)以大豆、马铃薯为原料，脱脂制成脱脂大豆粉；(2)低温水萃取液用不同饱合度的硫酸铵分级沉淀；(3)用硼酸缓冲液溶解的方法，制得粗酶液。本专利技术从脱脂大豆粉中提取含大豆脂氧合酶(Soybean Lipoxygenase，EC1.13.11.12)的粗酶制剂。粗酶制剂的制备方法是称一定量脱脂大豆粉，加10倍体积的水，冰浴中搅拌1hr，于10000r/min离心30min，加硫酸铵至40％饱合度静置过夜，于4℃，6,000r/min离心20min；在上清液中加硫酸铵至60％饱合度，静置过夜，于4℃，6,000r/min离心20min，将沉淀用0.1M，pH9.0的硼酸缓冲液溶解，所得粗酶液即粗酶制剂，可直接用作丁香酚、异丁香酚转化为香草醛的生物催化剂。或者将提取的粗酶液进行真空冷冻干燥，制备冻干酶粉作为生物催化剂，可以长期保存。或者，以上述方法制得的粗酶液，用海藻酸钠、卡拉胶、明胶、几丁质等载体包埋等方法，或者用树脂共价结合或吸附、戊二醛交联等方法固定化，制得固定化粗酶。以此作为酶源进行生物转化，固定化粗酶可反复回用，进行多次生物转化反应。脂氧合酶酶活力的测定方法，可本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙志浩，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：