酶活性减少的非典型流感嗜血杆菌的Ｐ４蛋白突变体制造技术

Ｐ４变异蛋白的酶活性减少且诱导野生型Ｐ４蛋白的抗体和／或具有抗非典型流感嗜血杆菌（ＮＴＨｉ）的良好杀菌活性，它用作人的免疫原性组合物中的活性成分。也提供了使用这些蛋白和组合物的方法，组合物含与另外的抗原组合的蛋白。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利技术的领域本专利技术一般涉及免疫原性组合物的领域，更具体是抗中耳炎的免疫原性组合物。专利技术的背景非典型流感嗜血杆菌(NTHi)引起人类疾病，包括成人中的肺炎、中耳炎、鼻窦炎和急性发热气管支气管炎。此细菌也是儿童和婴儿中耳炎的常见病原体。由于NTHi感染仅赋予菌株-特异的免疫性，人可被重复感染。事实上，此细菌引起的大部分慢性疾病是儿童的反复耳炎，使治疗包括反复接受抗生素或手术以将引流管插入耳中。现有治疗典型流感嗜血杆菌菌株的免疫原性组合物(其特征是一种已知的胶囊)中没有一种对治疗NTHi有用。因此，进行大量研究以发现用于防止NTHi引起感染的成分。在研究防止人中耳炎发生的候选成分中，称为NTHi蛋白4(P4；以前称为“外膜蛋白e”)的细菌脂蛋白被鉴定为所需成分，因为它能在人中引发针对细菌的杀菌抗体。发现P4引发杀菌抗体，与抗其它NTHi外膜蛋白的抗体协同作用。因此，此蛋白可结合其它外膜蛋白使用以诱导更有效的杀菌反应。编码P4的hel基因在流感嗜血杆菌菌株内和之间抗原性保守。参见例如美国专利号5,780,601；5,955,580和5,601,831及欧洲专利号EP 0 606 921和EP 0 462210，它们纳入本文供参考。hel基因序列(SEQ ID NO1)和编码的274个氨基酸的前蛋白序列(SEQ ID NO2)获得自NCBI数据库，登录号M68502并鉴定于Green，B.A.，等，1991 Infec.Immun.，59(9)3191-3198。NTHi的成熟P4是长度为254个氨基酸的脂化蛋白(SEQ ID NO3)，由SEQ ID NO1的核苷酸209-970编码。274个氨基酸的未加工前P4蛋白具有20个氨基酸的信号肽，特定作为脂肪酸酰化位点(SEQ ID NO2，氨基酸1-20)，此蛋白由SEQ ID NO1的核苷酸149-970编码，核苷酸149-208编码信号或前导肽。原来认为嗜血杆菌中P4蛋白的功能是氯高铁血红素转运(Reidl，J.，和J.J.Mekalanos.1996 J.Exp.Med.，183621-629.5)。然而，后来发现P4蛋白是外膜酶，即细菌酸性磷酸酶(Reilly，T.J.等，1999 J.Bacteriol.，1816797-805)。最近此领域的工作显示实验室对于P4蛋白的真正功能持不同观点(Kemmer，G.等，2001 J.Bacteriol.，1833974-3981；Reidl，J.等，2000 Mol.Microbiol.，351573-81；Reilly，T.，和A.Smith，1999 Prot.Exp.Purif.，17401-409；Reilly，T.J.等，1999.J.Bacteriol.，1816797-805；Reilly，T.J.等，2001 FEBSLett.，49419-23)。鉴定P4为酶蛋白产生对于其用作人免疫原性组合物成分的潜在关心。此蛋白是酶活性且未完全确定其体内底物。当野生型P4施用给人时没有已知的有害效果，一般认为在用于待施用给人的免疫原性组合物上，非酶活性蛋白或活性减少的蛋白优于酶活性蛋白。酶活性蛋白不优选用作免疫原性成分，因为除了诱导抗体，其酶活性可能在被免疫的人中引起意想不到的、不需要的反应。上述文献和专利描述的P4蛋白片段或变体“突变体”P4序列的特征不在于免疫原性组合物的最重要的性质即免疫原性。没有提供关于突变对免疫原性效果的信息。更没有提供影响酶活性的变化对潜在免疫原性有任何效果的征兆。因此，先有技术未提供任何指导用于选择产生免疫原性组合物成分的P4蛋白的突变体。本领域继续需要包含NTHi P4变异蛋白的治疗和预防性组合物，此变异蛋白酶活性减少且免疫性相当于野生型蛋白，安全用于人中的免疫原性组合物。专利技术的概述一方面，与野生型P4蛋白相比专利技术提供P4变异(突变)蛋白的酶活性减少且诱导野生型P4蛋白的抗体和/或具有抗NTHi的杀菌活性。此变异蛋白用于在被免疫人中诱导抗NTHi的保护性免疫反应。另一方面，专利技术提供免疫原性组合物，包含本文所述NTHi P4变异蛋白、药学上可接受载体和任选的佐剂。此组合物可含有另外的抗原性蛋白或肽并用于诱导抗NTHi的保护性免疫反应。又一方面，专利技术提供分离或重组核苷酸分子，包括编码本专利技术P4变体的核酸序列。专利技术也涉及载体，如质粒、重组病毒等，所含这些分子在指导宿主细胞中变体表达的序列调节控制下。另外一方面，专利技术提供包含载体的宿主细胞，载体含本文所述核苷酸分子。另一方面，专利技术包括通过施用变异蛋白或含它的组合物在人中诱导抗NTHi的免疫反应的方法。又一方面，专利技术包括宿主细胞重组表达P4变异蛋白的方法，宿主细胞用含这些分子的载体转化、转染或转导。另外一方面，专利技术包括使用P4变异蛋白作为另一种抗原的载体，其中另一种抗原可以是蛋白、多肽、肽、多糖、寡糖、糖类、脂多糖、脂寡糖或脂糖。变异P4蛋白与野生型P4蛋白相比酶活性减少，但不一定诱导野生型P4蛋白的抗体或具有抗NTHi的杀菌活性，以P4变异载体蛋白在SEQ ID NO3的氨基酸位置122没有苯丙氨酸为条件。专利技术的这些和其它方面对阅读下列专利技术详述的本领域技术人员是显而易见的。专利技术的详述本专利技术通过提供非酶活性的P4变异蛋白满足本领域的需求，此蛋白诱导野生型P4蛋白的抗体和/或具有抗NTHi的杀菌活性。含这类P4变异蛋白、编码它们的核酸分子的组合物及使用这些蛋白和核酸分子的方法提供诱导人中对NTHi免疫性的新方法。A.本专利技术的变异P4蛋白变异P4蛋白定义为突变P4蛋白，具有很低水平的P4酶活性或不能检测的P4酶活性。当用作免疫原性组合物的成分时，这些变异P4蛋白保持所需野生型P4蛋白的免疫原性性质。这些性质包括引发抗野生型P4的ELISA反应性抗体和/或抗NTHi的杀菌活性。当用作载体蛋白时，变异P4蛋白不需保持野生型P4蛋白的免疫原性性质。由于不知道防御NTHi的临床相关性，如果突变体发ELISA效价和/或杀菌效价相当于野生型重组脂蛋白P4(rLP4)，突变P4取代免疫原性组合物中的野生型P4才能成功。这种变异P4蛋白是用于预防NTHi感染的免疫原性组合物的所需成分。如本文所用，术语“变异P4蛋白”或“突变P4蛋白”指在氨基酸残基上携带特定突变的蛋白或脂蛋白，它显著地减少野生型P4酶活性且仍保持蛋白在人中诱导对NTHi免疫反应的能力。“免疫反应”或“免疫性”是在本文中交换使用的术语，指诱导体液(即B细胞)和/或细胞(即T细胞)反应。可适当评估体液免疫反应，这是根据本专利技术P4蛋白变体导入宿主，测量在免疫动物血清中存在的P4抗原-特异抗体。在下面的一个示范实施方案中，免疫反应通过酶联免疫吸收测定(ELISA)免疫动物的血清来评估。细胞毒性T淋巴细胞(CTL)测定能用于测量来自淋巴细胞的T细胞反应，淋巴细胞分离自免疫动物的脾。本专利技术的变异P4蛋白优选是脂蛋白，即它在氨基末端包含修饰的半胱氨酸，经硫醚连接脂肪酰化甘油且一个脂肪酸连接其末端氨基。在本专利技术P4变异蛋白的一个实施方案中，前导肽是流感嗜血杆菌的野生型P4前导肽，即SEQ ID NO2的氨基酸1到20。然而，其它用于细菌细胞中特定脂肪酰化位点的肽可融合P4变异蛋白，取代野生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种非典型流感嗜血杆菌（ＮＴＨｉ）的Ｐ４变异蛋白，与野生型Ｐ４蛋白相比酶活性减少且诱导野生型Ｐ４蛋白的抗体和／或具有抗ＮＴＨｉ的杀菌活性，其特征在于，Ｐ４变异蛋白具有的突变选自：（ａ）在ＳＥＱＩＤＮＯ：３的氨基酸残基３９的突 变，它在野生型Ｐ４蛋白中是谷氨酰胺；（ｂ）在ＳＥＱＩＤＮＯ：３的氨基酸残基４８的突变，它在野生型Ｐ４蛋白中是苯丙氨酸；（ｃ）在ＳＥＱＩＤＮＯ：３的氨基酸残基６４的突变，它在野生型Ｐ４蛋白中是天冬氨酸； （ｄ）在ＳＥＱＩＤＮＯ：３的氨基酸残基１６１的突变，它在野生型Ｐ４蛋白中是赖氨酸；（ｅ）在ＳＥＱＩＤＮＯ：３的氨基酸残基２１８的突变，它在野生型Ｐ４蛋白中是天冬酰胺；（ｆ）在ＳＥＱＩＤＮＯ：３的氨基酸 残基３５和３７的突变，它们在野生型Ｐ４蛋白中是丙氨酸，其中突变不是谷氨酸、谷氨酰胺或苏氨酸；（ｇ）在ＳＥＱＩＤＮＯ：３的氨基酸残基６４和６６的突变，它们在野生型Ｐ４蛋白中是天冬氨酸；（ｈ）一个或多个突变（ａ）－（ｇ） 的组合。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：BA格林，GW洛特尼克，LD弗莱彻，AL史密斯，TJ雷利，
申请(专利权)人：惠氏控股有限公司，密苏里州立大学校董，
类型：发明
国别省市：US[美国]