本发明专利技术提供了一种赤霉基因工程菌，所述的赤霉基因工程菌通过如下方法得到：利用ＰＣＲ技术分别扩增赤霉素合成的限速酶基因ｃｐｓ／ｋｓ和强启动子Ｐｇｐｄ或ＰｔｒｐＣ，并将它们克隆到能在丝状真菌中表达的目标质粒的相应位点，得到有强启动子驱动的ｃｐｓ／ｋｓ基因超表达载体，超表达载体再转化入赤霉菌，即得到所述的赤霉基因工程菌。本发明专利技术运用基因工程技术对赤霉菌进行改良，育种目标明确、效率高；所得工程菌合成赤霉素的能力强，比工程菌的出发赤霉菌菌株提高了４０％以上。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术提供了一种可产生赤霉素的赤霉基因工程菌及其制备与应用，属于基因工程领域。
技术介绍
赤霉素(gibberellins，GAs)是一种植物生长调节剂，在植物生长发育中有非常重要的作用。它可以促进植物的节间伸长，解除种子、块茎、芽的休眠，促进植物开花，能诱导单性结果及抑制衰老等。在水果、蔬菜、水稻等作物上赤霉素有广泛的应用。赤霉素还可以用于啤酒生产工业中。近年来，随着赤霉素的推广使用，市场需求量不断增长。赤霉素主要依靠微生物发酵生产，生产菌是水稻恶苗病菌藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)，赤霉素是该菌的异戊二烯类次生代谢物。赤霉素的生产至今已有近半个世纪的历史，几十年间，为了提高赤霉素产量，主要采用诱变育种及发酵工艺改进等传统的方法。但是，传统的菌株育种方法主要依靠随机的理化诱变，目标不明确，费时费力而且收效不明显。目前通过采用这些方法来提高藤仓赤霉合成赤霉素的能力已经很有限，潜力不大。
技术实现思路
本专利技术即是为了提供一种育种目标明确、效率高、合成赤霉素的能力强的赤霉基因工程菌，以及这种工程菌的制备方法与应用。为达到专利技术目的本专利技术采用的技术方案是一种赤霉基因工程菌，所述的赤霉基因工程菌通过如下方法得到利用PCR技术分别扩增赤霉素合成的限速酶基因cps/ks和强启动子Pgpd或PtrpC，并将它们克隆到能在丝状真菌中表达的目标质粒的相应位点，得到有强启动子驱动的cps/ks基因超表达载体，超表达载体再转化入赤霉菌，即得到所述的赤霉基因工程菌。所述的赤霉菌为藤仓赤霉。所述的目标质粒为下列之一①pCB1004 ②pCB1003 ③pCSN43 ④pCSN44 ⑤pSH75⑥pBARGEM5-1 ⑦pBARGEM7-1 ⑧pBARKS1⑨pBARGEM7-2 ⑩pBARMTE1制备所述的赤霉基因工程菌的方法，所述的方法如下利用PCR技术分别扩增赤霉素合成的限速酶基因cps/ks和强启动子Pgpd或PtrpC，并将它们克隆到目标质粒中的相应位点，得到有强启动子驱动的cps/ks基因超表达载体，所述的超表达载体再转化入赤霉菌，即得到所述的赤霉基因工程菌。具体的，所述的方法按如下步骤进行(1)PCR扩增Pgpd或PtrpC后将Pgpd或PtrpC克隆至目标质粒，得到重组质粒；(2)PCR扩增赤霉素合成酶基因cps/ks，PCR产物经凝胶回收后克隆至目标质粒的相应位点，即启动子Pgpd或PtrpC之后，得到cps/ks基因超表达载体；(3)赤霉菌接种培养5～15天后，洗下孢子转接至液体培养基在20～25℃100～300rpm培养24～48小时；(4)步骤(3)所得培养液过滤后离心得孢子沉淀，水洗后用0.1M醋酸锂溶液制成孢子混悬液；(5)取步骤(2)所得超表达载体，加入至孢子混悬液中，加入亚精胺至4mM，4℃温育30min后，加入40％PEG8000和0.1M醋酸锂4℃继续温育1h；(6)步骤(5)孢子混悬液用37℃水浴热激5min，将孢子水洗后接种到PDA平板上，20～25℃培养16～24h；(7)往步骤(6)PDA平板上覆盖一层含潮霉素100～200mg/L的1％琼脂培养基，继续培养5～10天，即得所述的赤霉基因工程菌。进一步，所述的方法按如下步骤进行(1)PCR扩增Pgpd后将Pgpd克隆至目标质粒，得到重组质粒；(2)PCR扩增赤霉素合成酶基因cps/ks，PCR产物经凝胶回收后克隆至目标质粒上Pgpd位点之后，得到cps/ks基因超表达载体；(3)赤霉菌接种到PDA培养基，20～25℃培养5～15天后，用无菌水洗下孢子，转接到YpSs液体培养基，20～25℃、100～300rpm振荡培养24～48小时；(4)步骤(3)所得培养液过滤后4000rpm离心5分钟得孢子沉淀，用无菌水水洗2～4次后，用0.1M醋酸锂溶液制成孢子混悬液；(5)取步骤(2)所得超表达载体，加入至孢子混悬液中，加入亚精胺至4mM，4℃温育30min后，加入40％PEG8000和0.1M醋酸锂4℃继续温育1h；(6)37℃水浴热激5min，将孢子用无菌水洗1～3次，接种到PDA平板上，20～25℃培养16～24h；(7)往步骤(6)PDA平板上覆盖一层含潮霉素100～200mg/L的1％琼脂培养基，继续培养5～10天，即得所述的赤霉基因工程菌。特别的，所述的方法按如下步骤进行(1)PCR扩增质粒pAN7-1上的强启动子Pgpd，将Pgpd通过限制酶Not I/BamH I克隆至质粒pCB1004的相应位点，得到重组质粒pCB1004Pgpd；(2)PCR扩增藤仓赤霉中的赤霉素合成酶基因cps/ks，PCR产物经凝胶回收后通过限制酶BamH I/Xho I克隆至pCB1004Pgpd的Pgpd位点之后，得到cps/ks基因超表达载体pCB1004Pgpd+cps/ks，简写为pCBcps；(3)赤霉菌接种到PDA培养基，24℃培养10天后，用无菌水洗下孢子，转接到YpSs液体培养基，24℃、200rpm振荡培养36小时；(4)步骤(3)所得培养液过滤后4000rpm离心5分钟得孢子沉淀，用无菌水水洗3次后，用0.1M醋酸锂溶液制成孢子混悬液；(5)取步骤(2)所得超表达载体pCBcps，加入至孢子混悬液中，加入亚精胺至4mM，4℃温育30min后，加入40％PEG8000和0.1M醋酸锂4℃继续温育1h；(6)37℃水浴热激5min，将孢子用无菌水洗2次，接种到PDA平板上，24℃培养20h；(7)往步骤(6)PDA平板上覆盖一层含潮霉素100mg/L的1％琼脂培养基，继续培养5～10天，即得所述的赤霉基因工程菌。所述的赤霉基因工程菌应用于制备赤霉素。所述的应用是将所述的赤霉基因工程菌以5～20％接种量接种到发酵培养基，在25～35℃、200～300rpm条件下发酵7～9天后，经分离纯化得到所述的赤霉素。通常，是将所述的赤霉基因工程菌以菌碟或孢子悬液接入种子培养基在25～35℃下培养24～48小时后，以5～20％接种量转入发酵培养基，在25～35℃、150～300rpm条件下发酵7～9天后，经分离纯化得到所述的赤霉素。本专利技术中所述培养基可为一切可用于培养赤霉菌的常规培养基。本专利技术中所用培养基如下PDA培养基(g/l)马铃薯，200；蔗糖，20；琼脂粉，15(1％PDA培养基中琼脂粉为10)；pH自然。在121℃下灭菌18分钟。YpSs液体培养基(g/L)酵母提取物，4；可溶性淀粉，15；KH2PO4，1；MgSO4·7H2O，0.5；pH自然。在121℃下灭菌18分钟。种子培养基花生饼粉，1.5％；糊精，1％；MgSO4·7H2O，0.1％；葡萄糖，1.5％；KH2PO4，0.1％；PH自然。在121℃下灭菌18分钟。发酵培养基玉米粉，1.5％；葵花油，6％；(NH4)2SO4，0.05％；KH2PO4，0.1％；pH自然。在121℃下灭菌18分钟。赤霉素类物质是植物生长调节剂，它有多种同系物，目前在自然界中已发现有一百多种，根据发现的早晚，这些同系物被命名为A1(GA1)、GA2、GA3、GA4、GA5……。目前已实现大量生产的是GA3，其结构式如下 本专利技术中所指赤霉素即为GA3。本专利技术所述本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种赤霉基因工程菌，其特征在于所述的赤霉基因工程菌通过如下方法得到：利用ＰＣＲ扩增或限制酶克隆或化学合成技术克隆赤霉素合成的限速酶基因ｃｐｓ／ｋｓ和强启动子Ｐｇｐｄ或ＰｔｒｐＣ，并将它们克隆到能在丝状真菌中表达的目标质粒中相应位点，得到有强启动子驱动的ｃｐｓ／ｋｓ基因超表达载体，超表达载体再转入赤霉菌，即得到所述的赤霉基因工程菌。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱廷恒，王渭霞，裘娟萍，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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