生产维生素C的方法技术

本发明专利技术涉及用分离自Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　　ｏｘｙｄａｎｓ　　ＤＳＭ４０２５（ＦＥＲＭ　　ＢＰ－３８１２）的醛脱氢酶从Ｌ－山梨糖酮生产维生素Ｃ的方法，所述醛脱氢酶具有如下物理化学属性：（ａ）分子量为１５０，０００±６，０００Ｄａ或２３０，０００±９，０００Ｄａ（由２或３个同源亚基组成，每个亚基具有７５，０００±３，０００Ｄａ的分子量）；（ｂ）对醛类化合物有底物特异性活性；（ｃ）辅助因子是吡咯喹啉醌和血红素ｃ；（ｄ）用于从Ｌ－山梨糖酮生产维生素Ｃ的最优ｐＨ为６．４至８．２之间；和（ｅ）Ｃｏ↑［２＋］、Ｃｕ↑［２＋］、Ｆｅ↑［２＋］、Ｎｉ↑［２＋］、Ｚｎ↑［２＋］、一碘乙酸和乙二胺四乙酸是其抑制剂。所述方法在存在电子受体的情况下进行，维生素Ｃ从反应混合物中分离出来。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及从L-山梨糖酮生产L-抗坏血酸(维生素C)的方法，其中使用醛脱氢酶，即从Gluconobacter oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)的无细胞提取物中纯化得到的L-山梨糖酮脱氢酶。上述的酶公开于EP 0 922 759 A2中，其催化从L-山梨糖酮到2-酮基-L-古洛糖酸(2-KGA)的氧化反应。维生素C对人类来说是非常重要且必不可少的营养因子。对维生素C的工业合成是通过“Reichstein方法”来进行的。D-葡糖醛酮和L-山梨糖酮是豆类和菠菜的维生素C生物合成途径中假定的中间产物，催化从L-山梨糖酮到维生素C的氧化反应的依赖尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)的酶已经被部分地纯化出来。然而，还未有关于用来源于细菌的酶将L-山梨糖酮转化为维生素C的报道。我们出乎意料地发现，该酶不仅能将L-山梨糖酮转化为2-KGA，在特定反应下还能将其转化为维生素C。本专利技术提供了从L-山梨糖酮生产维生素C的方法，所述方法包括在存在电子受体的情况下，将L-山梨糖酮与经过纯化的L-山梨糖酮脱氢酶相接触，以及从反应混合物中分离出得到的维生素C，所述L-山梨糖酮脱氢酶具有如下物理化学属性(a)分子量150,000±6,000Da或230,000±9,000Da(由2或3个同源亚基组成，每个亚基具有75,000±3,000Da的分子量)；(b)底物特异性对醛类化合物有活性；(c)辅助因子吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone)和血红素c；(d)最优pH用于从L-山梨糖酮生产维生素C的最优pH为6.4至8.2之间；(e)抑制剂Co2+、Cu2+、Fe2+、Ni2+、Zn2+、一碘乙酸和乙二胺四乙酸。就本专利技术的目的而言，术语“经过纯化的”也包括从其天然环境中分离出来的。在有电子受体存在的情况下，从L-山梨糖酮到维生素C的氧化按照如下的反应方程式发生当氧作为电子受体时，所述的酶不起作用。此外，尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)不是合适的电子受体。然而，其它常规的电子受体可与本专利技术的方法联合使用。2，6-二氯酚靛酚(2，6-dichlorophenolindophenol，DCIP)、甲硫吩嗪(phenazinemethosulfate，PMS)、氰化亚铁(ferriccyanide)和细胞色素c是优选的电子受体。对酶进行的试验可以按照下文所述来开展a)对L-山梨糖酮脱氢酶的活性进行产物(维生素C)试验反应混合物由1.0mM的PMS、25mM的磷酸钾缓冲液(pH7.0)、1.0μM吡咯喹啉醌(PQQ)、1.0mM的CaCl2、50mM的L-山梨糖酮和酶溶液加上水组成，其最终体积为100μl，在试验前现配现用。除非另有指明，所述反应都在30℃进行60分钟。通过高效液相色谱(HPLC)联合UV探测器(TOSOH UV8000；TOSOH Co.，Kyobashi 3-2-4，Chuo-ku，Tokyo，Japan)、双泵(TOSOH CCPE；TOSOH Co.)、积分器(ShimaduzC-R6A；Shimadzu Co.，Kuwahara-cho 1，Nishinokyo，Chukyo-ku，Kyoto，Japan)和柱子(YMC-Pack polyamine-II；YMC，Inc.，3233 Burnt Mill DriveWilimington，NC 28403，U.S.A.)，在264nm波长处对生产出的维生素C的量进行测量。生产出的2-KGA的量由HPLC来测量。酶活的一个单位被定义为在反应混合物中于60分钟内生产出1mg的维生素C或2-KGA的酶的量。b)对L-山梨糖酮脱氢酶的活性进行光度测定试验反应混合物由1.0mM的DCIP、1.0mM的PMS、50mM的磷酸钾缓冲液(pH7.0)、1.0μM的PQQ、2.0mM的L-山梨糖酮和酶溶液加上水组成，其最终体积为100μl，在试验前现配现用。于25℃从L-山梨糖酮开始反应，在600nm测量DCIP的初始还原率(initial reduction rate)，以得到酶活性。酶活性的一个单位被定义为每分钟催化1μ摩尔DCIP还原的酶的量。当pH为7.0时，DCIP的消光系数被计为14.2mM-1。用作对照的小管中含有除L-山梨糖酮之外的上述所有组分。根据EP 0 922 759 A2中描述的方法，可以从G.oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)的无细胞提取物(cell free extract)中分离出本专利技术的L-山梨糖酮脱氢酶。因此，本专利技术提供了上述从L-山梨糖酮生产维生素C的方法，其中，所述的L-山梨糖酮脱氢酶获得自G.oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)菌株、具有G.oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)的鉴定特征的属于Gluconobacter属的微生物或其突变体。根据《布达佩斯条约》的规定，G.oxydans DSM 4025于1987年3月17日被保藏在Gttingen(德国)的Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)，编号为DSM No.4025。送交保藏者是东方科学仪器进出口集团有限公司，其是为中华人民共和国北京市三里河路52号的中国科学院微生物研究所而送交的。有效的送交保藏者是所述的研究所，其完整地址是中国人民共和国北京市海淀区中关村中国科学院微生物研究所，100080。此外，该菌株的传代培养物也已于1992年3月30日被保藏在National Institute of Advanced Industrial Science and Technology(AIST)，Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki 305-8566，Japan，这也是根据《布达佩斯条约》的规定，保藏编号为FERM BP-3812。送交保藏者是Nippon Roche K.K.，6-1，Shiba 2-chrome，Minato-ku，Tokyo 105-8532Japan。该传代培养物也是本专利技术中最优选使用的。在培养了微生物G.oxydans DSM 4025(FERM BP-3812)之后，可以按照下述来对酶进行分离和纯化(1)通过离心或过滤从液体培养液中收获细胞。(2)用水、生理盐水或具有适当pH的缓冲溶液洗所收获的细胞。(3)将洗过的细胞悬浮于缓冲溶液中，通过均质机、超声波仪或法式挤压仪或者通过用溶菌酶进行处理等方式来对细胞进行破碎，以得到破碎细胞的溶液。(4)从破碎细胞的无细胞提取物中分离及纯化出所述的酶，优选是从微生物的胞质部分来进行分离和纯化。用于本专利技术所提供的方法的酶可作为催化剂用于从L-山梨糖酮来生产维生素C。反应可以在有电子受体例如DCIP、PMS等存在的情况下，在磷酸缓冲液、Tris缓冲液等溶液中，在大约6.4至大约9.0之间的pH和大约20℃至大约60℃之间的温度下，进行大约0.5至48小时。反应在大约7.0至8.2之间的pH和大约20℃至50℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从Ｌ－山梨糖酮生产维生素Ｃ的方法，所述方法包括：在存在电子受体的情况下，将Ｌ－山梨糖酮与经过纯化的Ｌ－山梨糖酮脱氢酶相接触，以及从反应混合物中分离出得到的维生素Ｃ，所述Ｌ－山梨糖酮脱氢酶具有如下物理化学属性：（ａ）分子量：１ ５０，０００±６，０００Ｄａ或２３０，０００±９，０００Ｄａ（由２或３个同源亚基组成，每个亚基具有７５，０００±３，０００Ｄａ的分子量）；（ｂ）底物特异性：对醛类化合物有活性；（ｃ）辅助因子：吡咯喹啉醌和血红素ｃ；（ ｄ）最优ｐＨ：用于从Ｌ－山梨糖酮生产维生素Ｃ的最优ｐＨ为６．４至８．２之间；（ｅ）抑制剂：Ｃｏ↑［２＋］、Ｃｕ↑［２＋］、Ｆｅ↑［２＋］、Ｎｉ↑［２＋］、Ｚｎ↑［２＋］、一碘乙酸和乙二胺四乙酸。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：星野达雄，宮崎太郎，杉泽辉秀，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]