对免疫系统分子进行人源化的方法技术方案

本发明专利技术公开了一种制造免疫系统分子，尤其是人源化抗体及其片段的方法。一种典型的方法优化各抗体构架区之间的相似性，以协助鉴定适合制造该分子的人类构架区。这样避免了较大抗体构架、超变区或两者之间之比较。还公开了经该方法人源化的抗体。本发明专利技术的用途很广，包括用于生产具有合适结合亲合性及尽量降低了的人类免疫原性的人源化单克隆抗体。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及制造人源化免疫系统分子的方法。本专利技术一方面提供对抗体进行人化的方法，其涉及使个别抗体构架区之间(而不在于使较大构架区或可变区之间)的序列相似性最优化。本专利技术有许多用途，包括用于生产具有合适结合亲合性并且人类免疫原性最小化的人源化单克隆抗体。
技术介绍
现已普遍认识到抗体有重要用途。例如许多抗体已知可以良好特异性检测抗原。已有文献报告多克隆及单克隆抗体。一般参见MolecularBiology of the Cell(B.Alberts等人编辑，第二版)(1989)GarlandPublishing，Inc.New York及其中引用的参考文献。过去对探讨抗体结构及功能有相当大的兴趣。例如对可变(V)区的结构与功能已有很多了解。几乎所有抗体V区均包括高变的互补性决定区(“CDRs”)及构架区(“FRs”)。对大多数抗体分子而言，单一CDR与另一个CDR之间被间插的FR所隔开。现已普遍认识到FRs充当分子骨架，有助于将CDR环定位在适当构象中，供抗原识别与结合。一般参见上述B.Alberts等人的文献及其中引用的文献。许多研究者使用“构架”来说明来自单一抗体轻链可变区(VL)或重链可变区(VH)的完整FRs。因此，一个抗体V区包括构架区亚群(FR1、FR2、FR3与FR4)，其中各亚群连接其相应的CDR(CDR1、CDR2与CDR3)。构架由来自单一抗体的整个构架区亚群组成。至少有些抗体的FRs的氨基酸残基被认为有助于抗原结合。参见Foote，J.and G.Winter(1992)J.Mol.Biol.224487。已有人尝试使用单克隆抗体作为治疗剂。然而，此方法却受到至少某些抗体的挑战。例如已报导有些人类个体在暴露于衍生自非人类来源的抗体之后发展出不期望的免疫副反应。在有些情形下，这些反应可能引起严重健康问题，并且可能危及生命。有人尝试制造对人类个体而言在免疫上更能接受的抗体。尽管已有一些人类单克隆抗体的报导，但普遍认为这样的分子很难制造和使用。另一种制造人类较能接受的抗体的方法是将编码人类抗体的基因引入非人类动物(例如小鼠)。已有报告指出这样的“转基因”动物可产生具有人类序列的抗体。然而，这样的动物通常很难制造，并且耗费时间。此外，这样的转基因小鼠享有产权，而且所拥有的人类抗体基因库仍不够多。另一个制造免疫上可接受的抗体的方法是使用重组DNA技术。一个观念是克隆并修饰非人类抗体，以产生类似人类抗体的分子。这样的抗体总称为“人源化的”。参见美国专利案Nos.5,766,886(授予Studnicka等人)、5,693,762(授予Queen等人)、5,985,279(授予Waldeman等人)、5,225,539(授予Winter)、5,639,641(授予Pedersen等人)及其中引用的参考文献。已有人提出几种使抗体人源化的具体方法。其中一种方法涉及制备被描述成嵌合抗体分子的分子。典型作法是使用抗原免疫非人类动物，如小鼠。然后采用常规技术，由该动物制造单克隆抗体。采用常规聚合酶链反应(PCR)扩增法生成编码该单克隆抗体的基因。编码鼠抗体可变区的分离序列经标准重组DNA技术与编码人类抗体恒定区的序列进行基因融合。此方法已用于制造人类-小鼠嵌合抗体。参见例如S.L.Morrison和V.Oi(1989)Adv.Immunol.4465。可惜仍有些报告指出有些嵌合抗体的制造及使用存在问题。具体而言，有文献公开该抗体对人体给药后会出现无法接受的免疫反应。循环半寿期短也被认为至少是有些嵌合抗体的问题。参见例如Boulianne等人的Nature312643(1984)；Junghans等人的CancerRes.501495(1990)and Bruggemann等人(1989)J.Exp.Med.1702153。其他制造人源化抗体的方法已有报导。其中一种方法称为“CDR移植法”(有时称为“构架移植”或“抗体重塑”)。CDR移植法涉及将鼠CDRs插入人类V区中。然后用该鼠CDRs替代相应的人类CDRs。参见E.Padlan，Mol.Jmmunol.28489(1991)。通常，V区内的所有FRs均衍生自单种人类抗体。所属领域中的有些人预测构架的人类FRs将会使鼠CDRs正确定位而结合抗原。预计这样的抗体应可避免被人类免疫系统所识别。参见例如Jones等人，Nature 321522-525(1986)；如上述Junghas等人的文献。然而，使用许多CDR移植技术也有问题。例如，有些“移植”抗体具有无法接受的抗原结合性质。参见Gorman等人，PNAS(USA)884181(1991)。改善抗原结合性的尝试通常是再将鼠残基加回到CDR移植的V区中，但并非总能成功。参见Queen等人，PNAS(USA)8610029(1989)；及Co等人，PNAS(USA)882869(1991)。也有人尝试采用所谓“抗体表面重塑”的方法制造人源化抗体。其中一种方法是以经常出现在宿主抗体中的氨基酸残基置换同种异基因抗体上的暴露氨基酸残基。此作法希望可以降低抗体的免疫原性，同时尽可能保留抗原结合功能。参见Roguska等人，PNAS(USA)91969(1994)。可惜多种这样的现有抗体重塑技术的使用仍有问题。例如，许多重塑抗体具有无法接受的抗原结合性质。参见E.Padlan，Mol.Immunol.28489(1991)。此外，大多数重塑技术需要详细了解所要重塑的抗体的结构。通常需要有关溶剂可及性及相关参数的详细信息。然而，对于需要人源化的抗体并非总能得到这样的信息。大多数抗体人源化技术共同的主要缺陷是对于需要人源化的所需抗体而言，需选用相当大的构架或V区来进行移植或重塑操作。使用这样的大型抗体区段作为加工非人类抗体的基础产生了不期望的结果，例如降低了抗原结合亲合性及保留了无法接受的免疫原性。为了克服这样的缺点，需进一步努力以恢复亲合性。这样的努力通常最终是在添加足量的非人类氨基酸残基来增强亲合性与避免添加太多氨基酸而使免疫原性提高之间取得妥协。更具体而言，据信许多已有的人源化技术涉及使用无法接受的大型抗体构架、或更糟糕地使用整个V区进行操作，使抗体人源化。根据其中一种方法，使用大型非人类构架或V区作为参考物，鉴别出与该参考物具有可接受的序列同一性的一组人类构架。所鉴别出来的人类构架若与参考的非人类序列在所使用的检索参数方面具有最高序列同一性时，则常常被称为“最佳匹配(best-fit)”。据信过去依据与相当大的构架或V区进行比较来选择最佳匹配的人类构架的作法已阻碍了许多人源化免疫系统分子的制造与使用。例如，据信采用过去的抗体人源化法已错失了许多有可能的“最佳匹配”类型。也就是说，将“最佳匹配”符合物群局限于构架或V区时，已降低了对许多抗体进行人源化的能力。此外，许多制造人源化抗体的现有技术采用完整抗体序列搜索“最佳匹配”符合物。然而，此方法有严重缺点。例如，这样的搜索法无法包括来自测序不完整的人类抗体的FR序列。此缺点导致很难利用更为完整的人类抗体序列信息库。制造人源化抗体的现有方法据认为仍有其他缺陷。例如，已知许多人源化抗体不具有最佳抗原结合亲合性。与人类FRs相邻的非人类CDRs的氨基酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备人源化抗体可变（Ｖ）区或其片段的方法，该方法包括：ａ）将非人类抗体可变（Ｖ）区的构架区（ＦＲ）的氨基酸序列与人类抗体构架氨基酸序列或其片段的序列集合库进行比较，ｂ）自集合库中选择出与该非人类ＦＲ具有最大氨基酸序列同一 性的人类ＦＲ序列，ｃ）对非人类ＦＲ的ＤＮＡ进行诱变，以编码具有与步骤ｂ）所选择出的人类ＦＲ实质上相同的氨基酸序列的人源化ＦＲ（ｈｕＦＲ），ｄ）对非人类Ｖ区中的各ＦＲ重复步骤ａ）至ｃ），以制备许多ＤＮＡ序列，其中各ＤＮＡ序列编 码一种人源化ＦＲ，ｅ）在至少编码该非人抗体的Ｖ区的第一载体内，用来自步骤ｄ）的各ｈｕＦＲＤＮＡ序列取代该载体所编码的相应非人类ＦＲ；其中该取代作用将各ｈｕＦＲｓ可操纵性连接至其相应的互补性决定区（ＣＤＲ）处；和ｆ）在有助 于制备人源化抗体Ｖ区或其片段的条件下在宿主细胞中表达该第一载体。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：HC翁，JR斯丁森，LA莫斯奎拉，
申请(专利权)人：苏诺尔分子公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]