由Phaffia制备玉米黄素制造技术

本发明专利技术公开了玉米黄素和β－隐黄素的生产方法，包括在水性营养培养基中，需氧条件下培养表达β－胡萝卜素羟化酶基因并且属于Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ属（Ｐｈａｆｆｉａ）的重组微生物，和从所述重组微生物的细胞或培养液分离所得的类胡萝卜素。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及叶黄素-类胡萝卜素的生产，特别涉及玉米黄素和β-隐黄素(cryptoxanthin)通过Phaffia属微生物进行生产。更特别地，本专利技术提供了一种叶黄素-类胡萝卜素的生产方法，特别是提供了一种玉米黄素和β-隐黄素通过遗传工程修饰的重组Phaffia属微生物进行生产的方法。用本专利技术的方法，可以在重组Phaffia属微生物中，生产有用的除虾青素以外的其它叶黄素-类胡萝卜素，如是主要叶黄素-类胡萝卜素的玉米黄素和β-隐黄素。能生产β-胡萝卜素的任何菌株都适合用作宿主菌。当选择的宿主菌是常规能从β-胡萝卜素生产虾青素的Phaffia菌株时，在导入和表达编码β-胡萝卜素羟化酶的基因后，就可以进行虾青素和其它叶黄素-类胡萝卜素混合物的生产了。另一方面，当选择不能生产虾青素但可以积累β-胡萝卜素的菌株用作宿主菌时，希望可以生产最大量水平的叶黄素-类胡萝卜素，如玉米黄素和β-隐黄素，而且最好还没有虾青素的积累。这种可以积累β-胡萝卜素的宿主菌，可以通过积累虾青素的P.rhodozyma突变而获得。可选择的方法之一是，例如，这种积累β-胡萝卜素的宿主菌可以通过灭活虾青素合成酶而获得。虾青素合成酶是参与虾青素从β-胡萝卜素进行生物合成的酶，该酶在US 6,365,386中有记载。使虾青素合成酶的基因断裂，将是灭活该酶最简便的方法之一。而且，这种可以积累β-胡萝卜素的宿主菌，也可以从公共典型培养物收集中心获得，例如积累β-胡萝卜素的P.rhodozyma菌ATCC96815，可以从美国典型微生物培养收集中心购买(P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA)。从自然界分离新的可积累β-胡萝卜素的P.rhodozyma菌株，则是另一制备本专利技术宿主菌的方法。需要说明的是，该分离菌株可以是虾青素生产菌的衍生物或自发突变株。本专利技术的一个方面是玉米黄素和β-隐黄素的生产方法，包括培养表达β-胡萝卜素羟化酶的重组Phaffia菌株。所述β-胡萝卜素羟化酶，在β-紫罗酮环3，3’位点催化β-胡萝卜素使其羟基化，经由β-隐黄素而可以生产出叶黄素玉米黄素。编码此酶的基因已经从多个物种分离得到，例如，来自黄杆菌属的(Flavobacterium)种的crtZ基因(US 6,124,113)，来自噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)的crtZ基因，来自草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)的crtZs基因，来自海洋细菌Agrobacterium aurantiacum种以及产碱菌属(Alcaligenes)种，或海洋细菌Paracoccus marcusii(GenBank accession No.Y15112，1997)的crtZ基因，而且Paracoccus carotinifaciens种nov.的β-胡萝卜素羟化酶基因也可以从植物获得。本专利技术可以使用任何可编码有β-胡萝卜素羟化酶活性的基因。优选地，所述β-胡萝卜素羟化酶基因可以从有β-胡萝卜素羟化酶基因的微生物中获得，这些微生物可以选自黄杆菌属，欧文氏菌属(Erwinia)，土壤杆菌属(Agrobacterium)，产碱菌属，和副球菌属(Paracoccus)属微生物。更优选地，所述β-胡萝卜素羟化酶基因可以从有β-胡萝卜素羟化酶基因的黄杆菌属的种R1534 WT(ATCC21588)(GenBank accession No.U62808)，噬夏孢欧文氏菌ATCC19321(GenBank accession No.D90087)，草生欧文氏菌ATCC39368(GenBank accession No.M87280)，Agrobacteriumaurantiacum(GenBank accession No.D58420)，产碱菌属PC-1(GenBankaccession No.D58422)，Paracoccus marcusii MH1(GenBank accession No.Y15112)，或者革兰氏阴性菌E-396(FERM BP-4283)(JP-A Hei 10-155497)获得。更优选地，所述β-胡萝卜素羟化酶基因可以从黄杆菌属的种R1534WT(ATCC21588)(GenBank accession No.U62808)获得，或者该酶也可以从基本上同源的DNA序列获得。术语“基本上同源的DNA序列”，对编码β-胡萝卜素羟化酶的DNA序列来说，是指编码氨基酸序列的DNA序列，其氨基酸序列与黄杆菌属的种R1534 WT(ATCC21588)crtZ基因的氨基酸序列相比时，有大于60％，优选大于70％，更优选大于80％，最优选大于90％的相同氨基酸，而且该氨基酸显示出与黄杆菌属(Flavobacterium)种R1534 WT(ATCC21588)crtZ基因编码酶有相同性能酶活性。使用β-胡萝卜素羟化酶基因，可以使Phaffia属微生物产生玉米黄素和β-隐黄素。表达β-胡萝卜素羟化酶基因的Phaffia重组微生物，可以通过已知的重组技术制备。分离和克隆编码本专利技术β-胡萝卜素羟化酶DNA的技术，是本领域已知的，包括从基因组DNA分离。从基因组DNA克隆本专利技术DNA序列，可能会受聚合酶链反应(下文中称为PCR)影响。分离或克隆编码β-胡萝卜素羟化酶的DNA，优选克隆在合适表达载体之后，用于在宿主微生物Phaffia中表达该酶。“表达载体”包括能表达包含其中DNA序列的载体，该序列可操作性地连接至其它序列，如调控序列。所述调控序列，能影响所述DNA序列在Phaffia微生物中表达。术语“可操作性地连接”是指，它们处于并排(juxtaposition)位置，其中所描述的成分处在这样一种关系中，即允许它们以预期的方式作用。术语“调控序列”，可以认为，至少应该包括对表达目的基因必需的那些成分，当然也可以包括其它的有益成分。一般来说，调控序列包括启动子，终止子，在某些情况下，还可以包括增强子，反式作用因子，或转录因子。组成型启动子，如来自P.rhodozyma甘油醛-3-脱氢酶(GAP)基因的启动子(WO 97/23,633)，可以用于获得组成型表达。也可以使用诱导型启动子，它能对表达精确调控。诱导性启动子的例子是，编码热休克蛋白或淀粉酶基因，以及类似基因的启动子。可以使用本领域普通技术人员熟知的方法，构建所述表达载体。虽然未明确陈述，但是本文已经暗示表达载体必须可以在宿主生物体中复制，它或者以游离基因(episome)形式进行复制，或者以染色体DNA整合的一部分进行复制。一般来说，基因的高稳定性，可以从后续事件中判断。要通过同源重组将表达载体整合进入宿主微生物染色体，那必须制备包含至少一部分与宿主基因组DNA同源的DNA片段的载体。为了达到上述目的，rDNA基因片段可以有效用在Phaffia微生物中。rDNA是一种卫星DNAs，在基因组中以多拷贝形式存在。将rDNA片段用作表达载体重组的靶向DNA，这样，表达在所述载体上的目标DNA，才能够整合进入宿主基因组，并且也以多拷贝的形式存在。多拷贝可以产生基因剂量效应，从而使目标酶过表达。在本专利技术的实施例中，这种rDNA片段可以方便地达到上述目本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产玉米黄素和β－隐黄素的方法，包括在水性营养培养基、需氧条件下，培养能表达β－胡萝卜素羟化酶基因并且属于Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ属（Ｐｈａｆｆｉａ）的重组微生物，以及从所述重组微生物细胞或培养液中，分离所获得的类胡萝卜素。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：星野达雄，尾岛和之，濑户口丰，
申请(专利权)人：DSMIP资产公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]