免疫原性减弱的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白制造技术

技术编号:1742407 阅读:169 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术提供鉴定枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白中CD4↑[+]T-细胞表位的方法。本发明专利技术还旨在生产改变的肽,当其被整合进野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白时则产生改变的免疫应答,优选在人体内为弱免疫应答。特别地,本发明专利技术提供手段,包括适于减弱ALCALASE*酶免疫原性的方法和组合物。(*该技术在2023年保护过期,可自由使用*)

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供鉴定枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白中CD4+T-细胞表位的方法。本专利技术还旨在生产改变的肽,当其被整合进野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白时则产生改变的免疫应答,优选在人体内为弱免疫应答。特别地,本专利技术提供手段,包括适于减弱ALCALASE_酶免疫原性的方法和组合物。
技术介绍
用于工业、药物和商业用途的蛋白质渐趋主导并越来越重要。然而,这使得大量个体对这些蛋白质致敏,导致对这些蛋白质的变态反应普遍发生。例如,在特定个体中一些蛋白酶与超敏反应相关联。因此,尽管蛋白酶在工业(例如,在洗衣洗涤剂、化妆品、织物处理,等中)上有用,并且在该领域中为了提供改进的蛋白酶(例如,在典型洗衣条件下能更有效去除污渍的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg酶变体)已经做了广泛研究,蛋白酶在工业上的使用还是有问题的。已经做了许多工作来缓解这些问题。已经开发的用于减弱蛋白酶应用免疫原性潜力的策略包括,通过控制和降低车间内携带有经空气传播的蛋白酶的粉尘颗粒和/或气溶胶的浓度来减少潜在接触的改良生产工艺,减少实际来自蛋白酶产品的粉尘或气溶胶的量的改良颗粒成型工艺,以及减少终产品中潜在的变应原性/免疫原性污染物水平的改良回收工艺。然而,相对来说降低蛋白酶自身变应原性/免疫原性的努力却不太成功。作为选择,已经努力尝试封闭蛋白酶上被超敏个体免疫球蛋白E(IgE)识别的表位(参见,PCT公开号No.WO 92/10755;WO 94/10191;WO 96/17929;WO 99/49056;和WO 01/07578),或通过在问题蛋白酶上附加聚合物或肽/蛋白质来放大或改变抗原决定簇的本性。尽管一些研究已经提供了降低特定蛋白质变应原性/免疫原性的方法以及鉴定一些个体中引起变态反应的表位的方法,但是用于鉴定这些表位的检测方法通常涉及测定事先已经暴露于这些抗原的个体血清中的IgE和IgG。然而,一旦已引发一种Ig反应,则致敏就已经产生。因此,需要鉴定产生增强免疫应答的蛋白质,还需要生产产生减弱免疫应答的蛋白质。专利技术概述本专利技术提供鉴定枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白中CD4+T-细胞表位的方法。本专利技术还旨在生产改变的肽,当其被整合进野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白时则产生改变的免疫应答,优选在人体内为弱免疫应答。特别地,本专利技术提供手段,包括适于减弱ALCALASE_酶的免疫原性的方法和组合物。本专利技术还旨在生产改变的肽,当其被整合进野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白序列时再也不能引发CD4+T-细胞应答或者至少使变态应答减弱。特别地,本专利技术提供手段,包括适于减弱野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg的免疫原性的方法和组合物。在一种实施方式中,本专利技术提供ALCALASE_酶的T-细胞表位。这些表位提供在本文所列的各序列(参见,附图2和3)中,包括但不限于第5号肽(SEQ ID NO6);第26号肽(SEQ ID NO27);第37号肽(SEQ ID NO38);第50号肽(SEQ ID NO51);第51号肽(SEQ ID NO52)以及第79号肽(SEQ ID NO80)。在另一种实施方式中,本专利技术提供适于置换入ALCALASE_酶的已鉴定表位的改变序列。在进一步的实施方式中,本专利技术提供鉴定T-细胞表位和T-细胞非-表位的检测系统,包括但不限于具有将分化的树突细胞与人CD4+和/或CD8+T-细胞结合以及与目的肽(例如,衍生自ALCALASE_酶的肽)结合的步骤的方法。更确切地,提供产生免疫应答减弱的目的肽,其中T-细胞表位通过以下步骤被识别(a)从单一血液来源获得树突细胞溶液和CD4+和/或CD8+T-细胞溶液;(b)促进树突细胞分化;(c)将分化的树突细胞溶液、CD4+T-细胞和/或CD8+T-细胞溶液与目的肽合并(例如,至少含有ALCALASE_一部分的肽);和(d)测定步骤(c)中T-细胞的增殖。(参见例如,WO99/53038;和Strickler等人,J.Immunother.,23654-660)。在专利技术的另一实施方式中,提供了一系列与ALCALASE_酶全部或部分对应的肽寡聚体。例如,构建了一个覆盖ALCALASE_酶相关部分或全部的肽文库。一方面,制备肽的方式是向肽文库中引入重叠,例如,制备与ALCALASE_酶氨基酸序列第1~15位对应的第一个肽、与ALCALASE_酶氨基酸序列第4~18位对应的第二个肽、与ALCALASE_酶氨基酸序列第7~21位对应的第三个肽、与ALCALASE_酶氨基酸序列第10~24位对应的第四个肽,直到产生与整个ALCALASE_酶分子对应的代表性肽。通过在本文所提供的检测方法中分别分析各肽,有可能精确鉴定由T-细胞识别的表位的位置。上述例子中,某一特定肽与其相邻肽相比反应更强使得在将表位锚定区限定至三个氨基酸变得容易。确定了这些表位的定位后,有可能在各表位内改变一或更多个氨基酸。之后可将经修饰的表位整合进野生型枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白主链。在特别优选的实施方式中,得到的修饰枯草杆菌蛋白酶Carlsberg蛋白产生不同的T-细胞应答,优选为与野生型蛋白产生的T-细胞应答相比减弱的T-细胞应答。此外,本专利技术提供鉴定天然具有令人满意的低T-细胞表位效力并能以天然产生形式进行利用的蛋白质的方法。本领域已知的各种体外和体内检测方法可用于确定根据本专利技术获得的修饰蛋白质的减弱的免疫应答。体内检测包括但不限于HLA II类应答,更确切的是HLA-DR3/DQ2小鼠T-细胞应答。适宜的体外检测包括但不限于人外周血单核细胞(PBMC)检测(参见例如,Herman等人,J.Immunol.,1636275-6282;Sonderstrup等人,Immunol.Rev.,172335-343;Taneja和David,Immunol.Rev.,16967-79;Taurog等人,Immunol.Rev.169209-223;Cosgrove,等人,Cell 661051-1066;和Grusby等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,903913-3917)。本专利技术进一步提供免疫原性减弱的修饰的枯草杆菌蛋白酶Carlsberg组合物。特别是,本专利技术提供ALCALASE_酶组合物,其中含有如本文所述可以降低针对ALCALASE_酶的免疫应答的表位。本专利技术还提供鉴定微生物枯草杆菌蛋白酶的至少一个T-细胞表位的方法,包括步骤(i)从单一人血液来源获得树突细胞溶液和原初CD4+和/或CD8+ T-细胞溶液;(ii)分化树突细胞以产生分化的树突细胞溶液;(iii)将分化的树突细胞和原初CD4+和/或CD8+ T-细胞溶液与枯草杆菌蛋白酶Carlsberg肽片段合并;和(iv)测定步骤(iii)中T-细胞的增殖。在一些优选实施方式中,微生物枯草杆菌蛋白酶Carlsberg来自芽孢杆菌(Bacillus)属的成员。在特别优选的实施方式中,芽孢杆菌选自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定微生物枯草杆菌蛋白酶的至少一个T-细胞表位的方法,其中所述枯草杆菌蛋白酶包括枯草杆菌蛋白酶Carlsberg,所述方法包括步骤:(i)从单一人血来源获得树突细胞溶液和原初CD4+和/或CD8+T-细胞溶液;(ii)分 化所述树突细胞以产生分化的树突细胞溶液;(iii)将所述分化的树突细胞溶液和所述原初CD4+和/或CD8+T-细胞与所述枯草杆菌蛋白酶Carlsberg的肽片段混合;以及(iv)测定在所述步骤(iii)中的所述T-细胞的增殖 。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员:FA哈丁
申请(专利权)人:金克克国际有限公司
类型:发明
国别省市:US[美国]

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