一种抗菌肽DC及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种抗菌肽ＤＣ及其制备方法与应用。本发明专利技术根据天然抗菌肽的序列，设计、合成抗菌肽ＤＣ基因，选择酵母偏爱的遗传密码，用ＤＮＡ合成仪合成，转化于穿梭质粒，转入季也蒙念珠菌中表达。筛选培养基配方及优化发酵条件，在发酵罐中高密度培养及高效表达，发酵液杀菌效价达１００００单位／ｍｌ。抗菌肽ＤＣ能杀灭多种病原微生物，革兰氏阳性、阴性细菌，白色念珠菌等真菌及阴道毛滴虫等原生动物，在制备消毒杀菌剂中有着重要的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体地说涉及一种抗菌肽。
技术介绍
昆虫抗菌肽(Cecropin)是通过注射大肠杆菌于柞蚕蛹诱导而产生的杀菌多肽。1981年，黄自然等首先报道分离到柞蚕抗菌肽，有B、D等多个成员，具有广谱杀菌功能。天然抗菌肽可用作药物原料。如1996年用作治疗肾炎、肝炎的新药“肾肝宁”。批准文号粤卫药准字(1996)第107388号，以投入生产。1997年，柞蚕素(含抗菌肽)胶囊作为西药二类治疗乙型肝炎已进入临床观察，批准文号(97)XL-29号。由于天然抗菌肽含量少，提取得率低(0.005％)，成本高未能工业化生产。1991年，根据蚕抗菌肽的氨基酸序列，设计合成抗菌肽AD基因，转化于啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达，通过发酵获得抗菌肽AD。已申报专利技术专利。公开号01107585.6。1992年，设计合成抗菌肽CAD基因，转化于毕赤酵母(Pichiapastoris)中表达，通过发酵获得抗菌肽CAD，已获专利技术专利授予权证书ZL 01107584.8及ZL 99117076.8。2004年，设计合成抗菌肽ADC基因，转化于粘质芽胞杆菌(Bacillus polymyxa)中表达，通过发酵获得抗菌肽ADC，已申请专利技术专利，待公开。以上3种抗菌肽基因(AD、CAD、ADC)，分别在啤酒酵母、毕赤酵母及粘质芽胞杆菌中表达。重组抗菌肽主要用作饲料添加剂，代替禁用的抗生素，防治小鸡、仔猪及对虾的疾病，效果良好，现已进入中试试产。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗菌肽DC。本专利技术的另一个目的是提供上述抗菌肽DC的制备方法。本专利技术的另一个目的是提供上述抗菌肽DC在制备消毒杀菌剂中的应用。本专利技术的技术方案1、抗菌肽DC基因的设计与合成根据天然抗菌肽的氨基酸序列，选用酵母属偏爱的遗传密码，设计合成抗菌肽DC基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。其编码的抗菌肽DC的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。该基因第11位氨基酸为赖氨酸(K)，密码为AAG，第12位氨基酸为缬氨酸(V)，密码为GTT。不同于抗菌肽ADC，因为ADC基因第11、12位氨基酸均为赖氨酸(K、K)；抗菌肽DC第38位氨基酸为赖氨酸(K)，密码为AAG，而ADC基因第38位为丙氨酸(A)，密码为GCT。以上两处改变对表达产物的杀菌活力有明显提高。2、抗菌肽DC基因的确认合成的抗菌肽DC基因及质粒pHIL-S1(市售，如图1)分别用EcoRI酶消化，用T4DNA连接酶将它们连接，构成重组质粒pHIL-DC，转化于大肠杆菌DH5(市售)。含抗菌肽DC基因的大肠杆菌DH5，在含氨苄青霉素的LB培养基中培养，挑取单菌落，摇瓶培养后从菌体中提取质粒，用EcoRI酶切后电泳得到约120bp的区带。以pHIL-DC重组质粒为模板，用以下引物进行PCR扩增。引物15’ATG AAA TGG AAG TTG TTA 3’引物25’TTA GTT CTT AGC CAA CGC 3’用2％琼脂糖凝胶电得到抗菌肽DC的DNA区带，测序结果与设计的编码区120bp一致。3、重组穿梭质粒的构建以pHIL-DC质粒为摸板，以引物1及2作PCR扩增。扩增产物回收后用EcoRI酶切，在低融点琼脂糖凝胶电泳，回收抗菌肽DC片段，用T4DNA连接酶与pPICZα-A质粒(市售，见图2)连接，连接前用小牛小肠碱性磷酸酶处理防止环化。连接后构建成穿梭重组质粒pPICZα-A-DC，见图3。4、筛选转化子将pPICZα-A-DC质粒转化于大肠杆菌Top10(市售)的感受态细胞，在含Zeocin(100μm/ml)的LB培养基中培养，挑选转化子。5、获得工程菌株含抗菌肽DC基因的大肠杆菌Top10中提取质粒pPICZ-A-DC，用氯化锂法转化于季也蒙念珠菌中，在含Zeocin(100μm/ml)的YE培养基中培养，30℃，48小时，挑取单菌落。摇瓶培养后检测各个菌落的杀菌效价，筛选工程菌株。6、Southern印迹杂交用地高辛试剂盒(市售)标记抗菌肽DC基因作探针，将工程菌的DNA经EcoRI酶切后进行Southern印迹杂交。筛选杂交阳性的菌株，作为工程菌保存。7、季也蒙念珠菌的鉴定季也蒙念珠菌两株CAD-1及CAD-2，季也蒙念珠菌(Candidaguilliermondii)属隐球酵母目，隐球酵母科，假丝酵母属。据1998年《真菌鉴定》手册共收入163个种。多分布在野生环境中，可以在食物中分离，又能寄生在动物及人体内，成为正常菌群的成员。该属中亦有某些致病菌如白色念珠菌(Candida albicans)。7.1形态特征菌落乳白色，圆形，凸起，湿润，呈乳酪状。菌体卵圆形2.5×4-6μm。在产子囊的培养基中形成子囊，多数子囊中有1个子囊孢子。液体培养时会产生白色沉淀。7.2发酵试验除葡萄糖外，麦芽糖、蔗糖、半乳糖、蕈糖、棉籽糖、蜜二糖及可溶性淀粉均不可能发酵。对硝酸盐不能同化。能利用1％甲醇作为碳源生长。7.3 API 20C AUX鉴定系统鉴别，季也蒙念珠菌的纸条鉴定结果如下所示葡萄糖 +肌醇 -甘油 +山梨醇+α-酮-D葡萄糖酸盐+ α-甲基-D葡萄糖甙 -阿拉伯糖 +N-乙酰-D葡萄糖胺 +D-木糖 +纤维二糖 +阿东糖 +乳糖 -木糖 -麦芽糖+ 半乳糖 +蔗糖 +棉籽糖 +松三糖+以上生化反应参照AUX试剂盒的电脑资料及《真菌鉴定手册》和《真菌特征与鉴定手册》，该菌鉴定为季也蒙念珠菌。8、抗菌肽的抑菌谱8.1抗菌肽DC的抑菌谱将抗菌肽DC调配成5000单位/ml的供试样本。用下列病菌于LB培养基中制成平板，打孔器打孔，5mm直径。每孔注入抗菌肽10μl，相当50单位。每种病菌重复5次。30℃培养24小时，测量抑菌圈直径，结果见下表1。表1抗菌肽DC的抑菌谱 8.2抗菌肽有效杀菌浓度(MIC)天然抗菌肽与重组抗菌肽DC的有效杀菌浓度与常用药物杆菌肽锌(Bactracin Zn)及恩诺沙星对比并设阴性对照。各试验取无菌试管3支标明药物浓度及作用时间。分别吸入所需药物5ml，在22℃水浴中5分钟，分别吸入供试细菌悬浊液0.1ml，迅速摇匀。在指定时间后分别吸取0.5ml菌液，注入4.5ml灭菌培养基中，在手掌中振荡80次，吸取0.1ml注入10ml预融的培养基中，注入7.5cm直径培养皿中制成平板。每个试管制备3个重复。30℃培养48小时，计算各平板上的菌落数(cfu)，取平均值，结果列于表2。抗菌肽及重组抗菌肽DC对大肠杆菌、沙门氏菌等革兰氏阴性菌及金黄葡萄球菌等革兰氏阳性菌均有明显抑菌效果。有效抑菌浓度为0.05μg/ml-0.01μg/ml，2分钟。常用杀菌剂杆菌肽锌及恩诺沙星为0.1-0.05μg/ml，3-4分钟。说明抗菌肽的MIC较常用杀菌剂为优。表2抗菌肽DC的有效抑菌浓度及作用时间 表中数字为菌落数(cfu) 天然抗菌肽0.01、0.05、0.1μg/ml；重组抗菌肽0.01、0.05、0.1μg/ml；杆菌肽锌0.01、0.05、0.1μ g/ml；恩诺沙星0.01、0.05、0.1μg/ml；*三个重复的菌落 8.3抗菌肽与常用抗生素青霉素对比重组本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗菌肽ＤＣ，其氨基酸序列如ＳＥＱＩＤＮＯ：２所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄自然，陈松彬，黄永彤，
申请(专利权)人：广州华桑生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]