一种反馈补料生产乳链菌肽的方法技术

本发明专利技术涉及一种反馈补料生产乳链菌肽的方法，包括使用常规方法制备种液，然后进行厌氧发酵，其特征在于：在厌氧发酵时，利用底物消耗量和酸的产生量之间的比例关系，通过加入底物和碱的混合流加液来控制体系的ｐＨ，以维持体系中的底物浓度在一适宜的范围内，使之既不产生底物抑制，也不构成限制。该方法利用ｐＨ值反馈控制补料，简化了生产工艺，在不增加额外设备的情况下使乳链菌肽的发酵产量（效价）大幅度提高，适合于工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生产乳链菌肽(又称乳酸链球菌素)的方法，具体地说涉及一种通过pH反馈控制补加有机碳源(底物)生产乳链菌肽的方法。
技术介绍
乳链菌肽是由乳酸乳球菌产生的一类细菌素，分子量约为3500Da。由于它可以抑制大多数的革兰氏阳性细菌，尤其是对引起食物腐败的芽孢杆菌、羧菌及葡萄球菌等有强烈的抑制作用，现已被50多个国家和地区批准作为无毒、安全的食品防腐剂来使用。乳链菌肽在乳制品领域中的应用具有很大的潜力。此外，在巴斯德消毒奶制品、罐头食品、肉制品及医药和兽药上也都有广阔的应用前景。乳链菌肽的生产厂家主要有英国的Aplin & Barrett公司和中国浙江银象生物工程有限公司，均采用的是批式发酵模式。在这种生产模式中，维持一定的底物(如蔗糖)浓度对于乳链菌肽的发酵非常重要。如果初始蔗糖浓度不够高，则底物(蔗糖)很快消耗完毕，至检测限以下，菌体停止生长，乳链菌肽的效价不高；反之，如果在一次性投料时加入较多的蔗糖，又会产生底物抑制，影响菌体生长。为了解决上述问题，一般采用在发酵过程中补料的办法，即在开始时只加入适量(限制浓度以上)的蔗糖，然后以某种方式再继续补加蔗糖，以维持蔗糖浓度在适宜的范围内，使之既不产生底物抑制，也不构成限制(缺乏)。补料发酵已经广泛应用于工业生产中。按补料方式可以分为间歇补料、连续补料和重复补料几种。连续补料又可分为恒速、指数和变速流加。虽然这些补料的方法可以消除限制性底物的抑制或缺乏，控制菌体的比生长速率，提高目的产物的产量以及实现细胞的高密度培养。但是这些现有的补料方法都是按照事先设定的程序进行操作，由于发酵生产的多变性，各批次之间有差异，而糖又不能在线检测，所以难以确切知道发酵过程中底物的实际变化，其补料具有盲目性，影响生产控制。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有生产乳链菌肽的方法在补料时具有盲目性、影响生产控制、使得发酵产量低的缺陷，提供一种通过检测发酵液中的pH变化，利用pH值反馈控制补料，从而简化生产工艺，在不增加额外设备的情况下使乳链菌肽的发酵产量(效价)大幅度提高的反馈补料生产乳链菌肽的方法。本专利技术的目的是通过如下的技术方案实现的本专利技术提供的反馈补料生产乳链菌肽的方法，包括使用常规方法制备种液，然后进行厌氧发酵，其特征在于在厌氧发酵时，利用底物消耗量和酸的产生量之间的比例关系，通过加入底物和碱的混合流加液来控制体系的pH，以维持体系中的底物浓度在一适宜的范围内，使之既不产生底物抑制，也不构成限制。该方法的具体步骤如下1)种液制备配制种子培养基，按常规方法灭菌；将菌种接入种子培养基，在适宜的温度下厌氧培养至对数期；所述的菌种是乳酸乳球菌(Lactococcus lactit)，包括乳酸乳球菌ATCC11454(美国标准菌种库)、乳酸乳球菌NIZO22186(荷兰乳品研究所)、乳酸乳球菌JCM7638(日本微生物保藏中心)。2)厌氧发酵将步骤1)制得的种液接入经常规方法灭菌的发酵培养基，控制适宜的温度，适度搅拌，不通气或通入适量氮气以保持厌氧环境；发酵过程中，随着底物转化为乳酸，从而导致发酵液的pH降低，当发酵液的pH降至设定点以下时，加入底物和碱的混合流加液直至pH回升至设定点；该发酵过程至乳链菌肽的效价达到最高时停止。其中，发酵培养基中起始底物浓度为1～20克/升，优选10克/升。接种量一般为1～10％。厌氧发酵的培养温度以25～35℃为佳。发酵液的pH设定点在6.0～8.0之间。所述流加液中底物的浓度为50～600克/升，碱与底物的比例为3～14毫克当量碱/克底物。所述的底物为蔗糖、葡萄糖、木糖、果糖、麦芽糖。所述的碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠或氢氧化铵，优选氢氧化钠。pH值的反馈控制可通过市售的pH电极(传感器)和仪表完成，也可由人工完成。对于乳链菌肽产生菌而言，由于属于同型乳酸发酵类型，乳酸合成与蔗糖消耗存在较好的线性关系，这就为pH反馈控制的实施提供了前提条件。同时，在乳链菌肽产生菌中，蔗糖消耗基因与乳链菌肽合成基因位于同一个操纵子上，蔗糖对乳链菌肽合成具有调控作用。因此，通过pH反馈控制蔗糖浓度，可以达到较佳的乳链菌肽产量。本专利技术提供的反馈补料生产乳链菌肽的方法，是基于这样的构思由于乳链菌肽产生菌乳酸乳球菌是同源乳酸产生菌，部分底物(如蔗糖)转化为乳酸，从而导致发酵体系的pH降低，在发酵过程中需要补加碱来维持pH的稳定。本专利技术根据底物消耗速率和乳酸产生速率的关系，将底物和碱按此关系配在同一溶液中，用该混合液中和发酵产生的乳酸从而调节pH值。在向发酵体系补加该混合溶液以调节pH的过程中，通过将pH控制在很窄的范围内，使得加入的碱量(按当量计)与产酸量相等，所以补加该混合液控制pH的同时，随同加入发酵体系的底物量正好补充了消耗的底物量，从而使底物浓度维持在一定范围。因而，只要将pH控制在很窄的范围内，就可以保证发酵体系中的底物浓度只在很窄的范围内波动。这样的方法可以在不改变生产设备的情况下，仅在补料罐中加入碱和底物，就能够在控制pH的同时实现发酵液中底物浓度的控制，即通过pH信号的反馈来间接控制底物的补加。而pH的控制是很成熟的技术，可以很方便的使用市售的pH电极(传感器)、控制仪表和执行机构来完成。用仪表设定拟控制的pH值的范围，由仪表自动控制。与现有技术相比，本专利技术提供的反馈补料生产乳链菌肽的方法的优益之处在于通过利用pH信号反馈控制底物的补加，从而间接控制了发酵液中的底物浓度，达到较准确的控制底物浓度的目的，并且可以提高目的产物乳链菌肽的产量。在发酵过程中不需要增加额外设备，而且补加的底物和碱的混合液不需要灭菌，操作简单，并可以缩短生产周期，获得较高的乳链菌肽产量，适合于工业化生产。具体实施例方式下面结合实施例进一步说明实施例1、使用的微生物菌种为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp.lactis)ATCC11454。用上述菌株进行pH反馈控制补料发酵，所用培养基有两种1)种子培养基蔗糖10克/升，酵母粉10克/升，磷酸二氢钾10克/升，氯化钠2克/升，硫酸镁0.2克/升。2)发酵培养基蔗糖2克/升，酵母粉10克/升，大豆蛋白胨10克/升，磷酸二氢钾10克/升，氯化钠2克/升，硫酸镁0.2克/升。将上述2种培养基成分和蒸馏水按配方混合后用NaOH和盐酸调pH值为6.80，于121℃灭菌。菌种接入种子培养基，30℃静置培养12小时，按1％的接种量接入含有发酵培养基的1升自动控制发酵罐中，发酵温度控制在29-31℃，pH控制在6.75-6.85，通入过滤除菌的氮气进行厌氧发酵，搅拌转速100转/分钟。发酵过程中通过流加蔗糖与氢氧化钠混合液控制pH及糖浓度，流加液中蔗糖浓度为300克/升，氢氧化钠浓度为135克/升。当pH降至6.75时，开始自动流加蔗糖与氢氧化钠的混合液至pH升至6.85。发酵至第10小时，乳链菌肽效价达到4961IU/ml。在发酵过程中残糖浓度维持在2-4克/升。与不补料的分批发酵的最高效价(2300IU/ml，第9小时，总蔗糖45克/升)相比，效价提高了1.1倍。实施例2、其他发酵条件同实施例1。发酵培养基的蔗糖浓度10克/升，发酵过程中通过流加蔗糖与氢氧化钠混合液控本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种反馈补料生产乳链菌肽的方法，包括使用常规方法制备种液，然后进行厌氧发酵，其特征在于：在厌氧发酵时，利用底物消耗量和酸的产生量之间的比例关系，通过加入底物和碱的混合流加液来控制发酵液的ｐＨ，以维持发酵液中的底物浓度在一适宜的范围内，使之既不产生底物抑制，也不构成限制。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吕文华，贾翠英，张晓燕，丛威，蔡昭铃，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]