本发明专利技术提供一种从海洋沉积物中同时提取微生物宏基因组ＤＮＡ和总ＲＮＡ的方法，包括将海洋沉积物用变性溶液处理，加入沙子振荡，加入蛋白酶和溶菌酶进行裂解，再加入ＳＤＳ和ＰＶＰＰ溶液进行进一步裂解，加入萃取剂进行处理，萃取液用异丙醇沉淀，最后用核酸吸附树脂进行纯化。该方法特别适用于从海洋沉积物中同时提取微生物宏基因组ＤＮＡ和总ＲＮＡ，同时也可应用于陆地土壤样品，陆地湖泊沉积物样品中微生物宏基因组ＤＮＡ和总ＲＮＡ的共提取。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种能从海洋沉积物中同时提取出微生物宏基因组DNA和总RNA的方法。
技术介绍
海洋，尤其是深海极端环境中微生物资源的研究开发中存在的一个关键问题就是样品中可以人工培养的微生物种类较少，直接影响了资源研究开发的范围。以核酸物质为基础的分子生物学技术的应用克服了培养技术的限制，为研究开发海洋，尤其是深海极端环境提供了强有力的手段。但是海洋，尤其是深海环境样品中的微生物含量很少，现有技术中的DNA提取方法在操作过程中由于黏土对核酸物质的吸附，抽提过程中的降解与损失，酶类、抑制剂等杂质的共提取及纯化效率的高低都影响着所得到的核酸物质的质量，从而限制了研究开发的进行，因此有必要建立一种方法用于高效地提取海洋环境中，尤其是深海沉积物中微生物中的核酸物质。许多实验方法已经描述了如何从土壤或湖泊沉积物中提取微生物宏基因组DNA(Wilson et al，1997；Leff et al.1995；Miller et al，1999)，也有商业用途的试剂盒，例如美国MBIO公司的UltracleanTM试剂盒，但这些方法都是针对生物量多或样品量多的样品，获得的DNA在大小，纯度方面有很多的区别，并且不能同时提取出微生物的DNA和RNA。而海洋，尤其是深海沉积物中生物量少，抑制剂成分复杂，而且样品获取不易。参考文献Wilson IG(1997)Inhibition and facilitation of nucleic acid amplication.Appl.Environ.Microbiol.633741-3751Leff LG，Dana JR et al.(1995)Comparison of methods of DNAextraction from stream sediments.Appl.Environm.Microbiol.61，1141-1143Miller DN，Bryant JE et al(1999)Evaluation and optimization of DNAextraction and purification procedures for soil and sediment samples.Appl.Environ.Microbiol.65(11)4715-4724
技术实现思路
本专利技术提供一种从海洋沉积物中同时提取微生物宏基因组DNA和总RNA的方法。本专利技术的目的在于提供一种与现有技术相比较更经济、简便、易行的方法，以从海洋沉积物中同时提取出高纯度，分子大小在30kb以上的微生物宏基因组DNA和总RNA。该方法同时也可以应用于陆地土壤样品，陆地湖泊沉积物样品中微生物宏基因组DNA和总RNA的共提取。为实现上述目的，本专利技术所采用的操作步骤为(1)用变性溶液和沙子处理沉积物样品；(2)向上述步骤(1)处理后的样品中加入核酸提取缓冲液和酶进行裂解；(3)向上述步骤(2)的样品中加入SDS和PVPP溶液进行处理并离心得到上清液；(4)重复上述步骤(2)，(3)两次，收集三次离心得到的上清液；(5)向上述步骤(4)中的上清液中加入萃取剂进行处理并离心得到上层水相溶液；(6)向上述步骤(5)中的水相溶液中加入异丙醇沉淀并离心去除上清液，所得沉淀用水重新溶解，得到核酸物质粗提液；(7)向上述步骤(6)中的核酸物质粗提液中加入吸附树脂；(8)洗脱吸附于树脂上的核酸物质并离心得到含有核酸物质的滤液；(9)沉淀滤液中的DNA和RNA。若需要DNA，则在纯化后的溶液中加入RNAase处理，若需要RNA，则在纯化后的溶液中加入DNAase酶处理。上述步骤中所有的试剂和容器均经DEPC浸泡处理，或180℃烘干3h。上述步骤(1)是指海洋沉积物采集后立即进行操作或于-80℃以下的温度中冷冻保存后进行提取，在0.5-5g样品(湿重)中加入1.5mL变性溶液，混合均匀，加入高温烘烤过(150-200℃，2-3h)的沙子，水平激烈振荡10-20min，加入15mL核酸提取缓冲液、蛋白酶K、溶菌酶，混合均匀后在30-37℃的条件下振荡30-50min。此步骤中，样品最好为液氮保存，沙子的最佳处理方式为180℃烘烤3h；上述步骤(1)中的变性溶液是4-6M异硫氰酸胍10mM Tris-HCl(pH 7.0-8.0)缓冲液1mM EDTA0.5％2-巯基乙醇(混合溶剂，终浓度)。上述步骤(2)中的核酸提取缓冲液是100mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)100mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0-8.0)100mM EDTA(pH8.0)1-2M NaCl1％CTAB5-15％蔗糖(混合溶剂终浓度)。上述步骤(2)中的酶为蛋白酶K(终浓度50μg/mL)和溶菌酶(终浓度3-4mg/mL)同时使用。上述步骤(5)中的萃取剂是苯酚∶氯仿∶异戊醇(混合溶剂，体积比为25∶24∶1，pH 4.0-5.0)。上述步骤(8)中的洗脱液是Tris醋酸(混合溶剂，40mmol/L，pH8.0-8.5)和EDTA(2mM，pH8.0)的混合溶剂在步骤(1)中，变性溶液成分为4-6M异硫氰酸胍，10mMTris-HCl缓冲液(pH7.0-8.0)，1mM EDTA，0.5％2-巯基乙醇(均为终浓度)；最优化条件为4M异硫氰酸胍，10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，1mM EDTA，0.5％2-巯基乙醇(均为终浓度)在步骤(2)中，核酸提取缓冲液成分为100mM磷酸钠缓冲液PH7.5，100mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM EDTA(pH8.0)，1-2MNaCl，1％CTAB，5-15％蔗糖溶液(均为终浓度)。最优化条件为NaCl浓度采用1.5M，蔗糖溶液浓度采用10％；在步骤(1)，(2)中，最优化的条件为每5g样品对应于1.5mL的变性溶液和15mL核酸提取缓冲液，蛋白酶K的终浓度为50μg/mL，溶菌酶的终浓度为3mg/mL，振荡温度为37℃，时间为30min。在步骤(3)中，最优化的条件为加入每5g样品加入1.5mL含20％SDS和2％PVPP的溶液，水浴温度为65℃。在步骤(4)中的重复提取过程最优化条件为每5g原始样品加入5mL核酸提取缓冲液和1mL 20％SDS溶液在步骤(5)中的使用的苯酚的最佳pH值为4.5，抽提液与上清液的最适体积比为1∶1。本专利技术中的提取方法的特性及优点是1)在步骤(1)中，在样品中先加入变性溶液再进行提取有利于保护RNA，同时变性剂pH值采用7.5，而不是一般采用的7.0能大大提高后续的细菌裂解效率。2)加入沙子进行水平剧烈振荡，简化了一般采取的液氮冻融研磨的步骤，同时又保证了相同的提取效率。3)在步骤(2)，DNA抽提缓冲液中加入10％蔗糖溶液能减少提取过程中对DNA分子的剪切，加入溶菌酶能保证最大限度地裂解沉积物中的微生物。4)在提取过程中加入PVPP将有效去除沉积物中的腐殖酸等抑制剂，对于小于0.5g的样品，可以不经纯化，直接将粗核酸物质溶液应用于分子生物学操作。具体实施例方式实施例一1.海洋沉积物采集后于-80℃以下的温度中冷冻保存后进行提取；2.在5g样品中加入1.5mL变性溶液(4M异硫氰酸胍，10mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从海洋沉积物中同时提取微生物宏基因组ＤＮＡ和总ＲＮＡ的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：（１）用变性溶液和沙子处理沉积物样品；（２）向上述步骤（１）处理后的样品中加入核酸提取缓冲液和酶进行裂解；（３）向上述步 骤（２）的样品中加入ＳＤＳ和ＰＶＰＰ溶液进行处理并离心得到上清液；（４）重复上述步骤（２），（３）两次，收集三次离心得到的上清液；（５）向上述步骤（４）中的上清液中加入萃取剂进行处理并离心得到上层水相溶液；（６）向上 述步骤（５）中的水相溶液中加入异丙醇沉淀并离心去除上清液，所得沉淀用水重新溶解，得到核酸物质粗提液；（７）向上述步骤（６）中的核酸物质粗提液中加入吸附树脂；（８）洗脱吸附于树脂上的核酸物质并离心得到含有核酸物质的滤液； （９）沉淀滤液中的ＤＮＡ和ＲＮＡ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曾润颖，赵晶，
申请(专利权)人：国家海洋局第三海洋研究所，
类型：发明
国别省市：92[中国|厦门]
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