生产能产生或修饰代谢途径的进化微生物的方法技术

本发明专利技术涉及制备能修饰代谢途径的进化微生物的一个新的方法，其特征为其包括以下步骤：ａ）通过对原始微生物细胞的基因修饰生产修饰的微生物，如在可影响微生物生长的特定培养基中培养微生物时抑制代谢物的生成和吸收，ｂ）培养从前述特定的培养基中得到的微生物以诱导所述细胞发生进化，有时有必要向特定培养基中加入共同底物以促进所述的进化，ｃ）选择可在特定培养基中进化的修饰微生物，此特定培养基可任选地含有共同底物。本发明专利技术还涉及如上所述得到的进化微生物、通过所述方法得到的编码进化蛋白质的进化基因以及所述的进化微生物、基因或蛋白质在生物转化方法中的应用。（*该技术在2024年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种制备可以产生或修饰代谢途径的进化微生物的方法，和根据本法所产生的进化微生物及编码其进化蛋白的基因，以及所述的进化微生物，基因或蛋白质在生物转化过程上的应用。制备修饰其性质的微生物是很常见的方法。其目的在使微生物在具有选择压力的生长培养基中生长，从而选择那些能够抵抗压力的微生物，或者用基因工程技术导入一个或多个异种基因，从而使此微生物产生与所述异种基因表达有关的表现型特征。对于本领域技术人员，此类进化可通过使用突变剂轻易达成。通过除去培养基中某种成分转化所必需的基因以在选择压力下生长，和利用突变剂生长进化微生物的方法已于FR 2 823 219和WO 03/004656中有所叙述。
技术实现思路
本专利技术涉及一种制备能产生或修饰代谢途径的进化微生物的方法，其特征在于其包括以下几个步骤a)修饰原始微生物的细胞使其在某种特定的培养基中生长时抑制代谢物的生成或消耗，从而对微生物的生长造成负面的影响。如细胞未经修饰，微生物则能产生或消耗此代谢物，并能够在相同的特定培养基中正常生长。b)使前项所得的经修饰的微生物在所述特定的培养基中培养使其发生进化，其中特定的培养基中可能包括进化所需的某种共同底物。c)筛选能够在此适当地含共同底物的特定的培养基中生长的修饰微生物。此进化微生物优选至少含有一个编码进化蛋白的进化基因。此进化过程可使受抑制的代谢途径被一个新的代谢途径所取代。本专利技术还涉及一个包括在使修饰微生物生长的步骤b)前另加的一个步骤a1)的方法，在所述步骤a1)中，将至少一个编码异种蛋白的异种基因导入，其中此异种基因可预期产生进化而演化出一条新的代谢途径。本专利技术还涉及一种包括将编码进化蛋白的基因分离的步骤d)的方法。本专利技术还涉及一种方法，其为将根据本专利技术得到的进化基因以某种适合的形式导入某种用于生产的微生物中，进而生产此进化蛋白。本专利技术还涉及一种由本专利技术上述或下列方法所获得的进化微生物。本专利技术还涉及一种制备进化蛋白的方法，其特征为使根据本专利技术的进化微生物在一种合适的培养基中生长从而生产进化蛋白并在有必要时将此蛋白纯化。本专利技术还涉及一种由本专利技术上述或下列方法所获得的编码进化蛋白的进化基因。本专利技术还涉及一种由本专利技术上述或下列方法所获得的进化蛋白。本专利技术还涉及由本专利技术上述或下列方法所产生的进化微生物或进化蛋白质在生物转化过程中的应用。定义本专利技术将‘进化微生物’定义为由修饰微生物经筛选而获得的微生物。进化微生物与修饰微生物至少有一点不同。此不同可以为，例如其酶学特性有所改善或能产生一条新的代谢途径。本专利技术将‘代谢途径’定义为经一个或多个酶促反应产生了一种分子(产品)而这分子与反应前存在的分子(底物)有所不同。根据本专利技术‘修饰’定义为一种改变，特别是指至少一种编码酶的基因和/或此基因的启动子的缺失。根据本专利技术‘代谢物’定义为由微生物合成和/或转化的分子。根据本专利技术‘特定的培养基’定义为一种分子组成已知且适合微生物生长的培养基。特定的培养基实质上不含任何代谢物，其产物通过修饰而被抑制。根据本专利技术‘共同底物’定义为一种与底物不同的有机或无机分子，此分子参与反应并将其一个或多个原子供给底物从而产生一个新的产品。共同底物并不具所认知的突变特性。根据本专利技术‘筛选’定义为一种用来筛选已进化的微生物的培养方法，其中该微生物的生长已不受修饰所影响。一种优选的用途是连续培养的方法，其用稀释率不断增高的方法进行，从而仅有那些生长率等于或高于所定稀释率的微生物存留在培养基中。根据本专利技术‘进化基因’定义为一段由A，T，G或C组成的由终止密码子(TAA，TAG，TGA)所限制的核苷酸序列。在筛选后，至少一个核酸与原序列不同，如此经此进化基因编码所得的蛋白与经原有基因编码所得的蛋白至少有一个氨基酸的差异。根据本专利技术‘异种基因’为由起始密码子(ATG或GTG)和终止密码子(TA，TAG，TGA)所包围的一核苷酸序列。这序列又称为编码序列，其来源于与进化和/或生产所用微生物不同的生物体。根据本专利技术‘进化蛋白’定义为一氨基酸序列(蛋白序列)，其在筛选后，至少一个氨基酸与与原蛋白序列不同。根据本专利技术‘异种蛋白’定义为经异种基因翻译所得的蛋白。基因与蛋白可由其主要序列确认，还可经序列或序列对比同源性确定同组蛋白。PFAM(对比性与隐马尔科夫模型蛋白家族数据库；http://www.saneer.ac.uk/Software/Pfam/)存有大量蛋白序列对比性的讯息。每个PFAM能显示多重对比性，展示蛋白质结构域，评估在微生物中的分布，取得进入其他数据库的条件及观察已知的蛋白结构。COGs(具同源件的蛋白质簇；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)是由与代表30个主要动植物系的43个全长基因组序列来源的蛋白序列比较而得。每个COG至少由3个系确认以便鉴定其固有的保守结构域。本领域技术人员对鉴定同源系列及其同源性百分比的方法十分熟悉，其中包括可由网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/进入的BLAST程序，其默认参数值均登载在网址上。所得的序列尚可利用CLUSTALW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)或MULTALIN(http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)等程序作进一步的探索(对比)。其默认参数值均登录在网站上。对本领域技术人员而言，利用基因库(GenBank)所提供的基因资料可确定在其他生物体，细菌株，酵母，真菌，哺乳动物，植物等中存在的对等基因。这项常规工作有利地是将从其它微生物中获得的基因进行对比得道共有序列，然后再设计退化探针在另一生物体内克隆相应的基因。这些分子生物学的常规方法对本领域技术人员而言是非常熟悉的，而且这些方法亦在例如萨姆布鲁克等所著的书内有所描述(分子克隆实验指南，1989，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)。根据本专利技术在进化株上被缺失或过度表达的基因主要是应用大肠杆菌基因命名定义的。但根据本专利技术，此种应用更是常规的方法，其包括了在其他微生物中的相应基因。利用基因库所提供的大肠杆菌基因信息，本领域技术人员可认定在其他细菌体内的相应基因。根据本专利技术，‘新代谢途径’是指一组一个或多个酶促反应，反应后产生一种化学产物。在筛选进化微生物后其酶活性在同一代谢途径中与未经进化的微生物有所不同。此种不同可为催化反应的类型不同或具有不同的动力学特性(Km，Vmax，Ki，等)。一个新的酶学途径能从一个与最初底物相同或不同的底物中产生一个与最初化学产物不同或相同的化学产物。根据本专利技术，‘适当形态’是指一个由起始密码子(ATG或GTG)和终止密码子(TAA，TAG，TGA)所包围的核苷酸序列。这序列称为编码序列或为编码序列的一部分。在所需要的调控子控制下使异种基因在微生物中表达。这些调控子，包括启动调控子或启动子，特别是在微生物中称为强构建启动子的启动子，对本领域技术人员而言是非常熟悉的。构成启动子优选地选自pTAC-O，pLAC-O，pTRC-O或使lac操纵子缺失而构建的强启动子，pTHLA。根据本专利技术，‘原始微生物’是指一株从未经过修饰，突变或进化的微本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可用来修饰代谢途径的进化微生物的制备方法，其特征为此方法包括以下数个步骤：ａ）利用细胞的基因修饰从一个原始微生物制备一个修饰微生物，使此被修饰的微生物在一个特定的培养基生长时抑制某种代谢物的产生或消耗，因而使其生长能力受损；ｂ）在前述的特定的培养基中培养此修饰微生物使其进化，此特定的培养基含可促成进化的共同底物；ａ）筛选能在此特定的培养基（必要时含有共同底物）中生长的修饰微生物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：M沙托，B冈萨雷斯，I梅尼亚尔萨勒，PNP苏凯勒，O赞克，
申请(专利权)人：代谢开发公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]