使用肺炎克雷伯氏菌生产1,2-丙二醇的方法技术

本发明专利技术提供了一种产生１，２－丙二醇的方法。所述方法包括于需氧条件下，将肺炎克雷伯氏菌培养在包含１０－３０ｇ／Ｌ的糖碳源的培养基中，所述糖碳源不包括６－脱氧已糖；并从所述培养物中分离１，２－丙二醇。使用所述方法，通过将肺炎克雷伯氏菌培养在包含更廉价糖碳源的培养基中可以产生高产量的１，２－丙二醇。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】,2－丙二醇的方法
本申请要求2003年4月2日提交给韩国知识产权局的韩国专利申请号2003-20734的优先权，将其全部内容并入本文作为参考。本专利技术涉及使用肺炎克雷伯氏菌(Klebsiela pneumoniae)生产1，2-丙二醇的方法。
技术介绍
1，2-丙二醇是一种用于生产旋光化合物中的非常有用的中间体，所述旋光化合物包括药物、农业化学制品、抗冻物和生理活性试剂。按照已知的产生1，2-丙二醇的化学合成路径，1，2-丙二醇可以通过衍生自丙烯的丙烯氧化物的氢化作用来产生。当通过这种化学合成路径产生1，2-丙二醇时，过量的水是必须的以抑制聚乙二醇的产生。此外，涉及1，2-丙二醇的产生的丙烯氧化物的产生需要昂贵的化学催化剂并且会导致大量的副产物，诸如氯乙醇和chroline，其导致了环境污染。在产生1，2-丙二醇的已知生物方法中，通过使用大肠杆菌(E.coli)和其它微生物，将L-鼠李糖和L-岩藻糖用于产生它。但是，L-鼠李糖和L-岩藻糖非常昂贵并且使用这些材料是不经济的。Cameron等公开了一种使用热解糖好热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)HG-8(ATCC 31960)从葡萄糖中产生1，2-丙二醇的方法(Biotechnol.Prog.2001，卷17，第52～56页)。授权给Cameron等的美国专利号6,303,352公开了一种使用重组大肠杆菌从葡萄糖中产生1，2-丙二醇的方法。然而上面列出的所有的常规方法使用的菌株不包括肺炎克雷伯氏菌。已知的是，当将肺炎克雷伯氏菌培养在包含6-脱氧已糖，诸如鼠李糖和岩藻糖的培养基中时，在厌氧条件下，1，2-丙二醇的产量增加。还已知使用肺炎克雷伯氏菌在需氧和厌氧条件下都可以从葡萄糖中产生1，2-丙二醇。然而，对于商业化来说，产自葡萄糖的1，2-丙二醇的产量太低(Juan Aguilar等，J.Bact.Jan.1985，435-437)。研究已经集中于使用肺炎克雷伯氏菌从非糖碳源、价格低廉的糖碳源，诸如包括鼠李糖和岩藻糖的6-脱氧已糖中产生1，2-丙二醇的高效方法。结果，本专利技术人发现当将肺炎克雷伯氏菌于需氧条件下培养在包含大量常见糖碳源，诸如葡萄糖的培养基中时，1，2-丙二醇可以以高产量产生。最佳方式本专利技术将参考随后的实施例更详细地进行描述。随后的实施例是说明性的而不意欲限制本专利技术的范围。实施例1培养肺炎克雷伯氏菌以产生1，2-丙二醇将登记号为ATCC 25955的肺炎克雷伯氏菌培养在具有下面表1中组成的培养基中以进行1，2-丙二醇的生产。生产1，2-丙二醇的培养基的pH为6.8。表1.1，2-丙二醇生产培养基的组成 将50mL的培养基注入250mL的挡板烧瓶中并在压力下于121℃灭菌15分钟。加入培养基中的葡萄糖也单独灭菌。将灭菌的培养基和葡萄糖充分混合以获得生产1，2-丙二醇的培养基。将预培养在营养琼脂(NA)平板上的肺炎克雷伯氏菌ATCC 25955接种在20mL LB肉汤中并于200rpm下培养24小时。将1mL培养的肉汤接种在培养基上进行1，2-丙二醇的生产并在37℃和200rpm培养24小时。实施例2培养物中1，2-丙二醇的定量测量获自实施例1的培养物中的1，2-丙二醇的量。将1ml的培养物收集到1.5mL的管中并在12,000rpm离心10分钟。将离心所得的上清液转移到空管中并用无菌蒸馏水进行5倍稀释。使用高效液相色谱(HPLC)测量在每个稀释样品中1，2-丙二醇的量。将结果显示于下面的表2中。如表2中所示，1，2-丙二醇产生的量是3.838g/L，比通过使用常规方法(Juan Aguilar等，J.Bact.Jan.1985，435～437)获得的1，2-丙二醇的量要高。表2在培养物中1，2-丙二醇的量 实施例3通过添加有机酸中间代谢物提高产量研究了加入延胡索酸作为有机酸中间代谢物对1，2-丙二醇产量的影响。出于此目的，将1mM/L的延胡索酸加入实施例1中制备的产生1，2-丙二醇的培养基中。将肺炎克雷伯氏菌ATCC 25955在与实施例1相同的条件下，培养在包含延胡索酸的培养基中，并且使用如实施例2所用的相同方法测量产生的1，2-丙二醇的量。结果显示于下面的表3中。如表3中所示，与实施例2的结果相比，2，3-丙二醇的产量显著增加，实施例2中没有添加延胡索酸到实施例1制备的产生1，2-丙二醇的培养基中。表3使用含延胡索酸的培养基产生的1，2-丙二醇的量 基于上述实施例的结果，证实了通过于需氧条件中，将肺炎克雷伯氏菌培养在包含过量糖碳源的培养基中可以产生比使用常规方法所产生的更高的1，2-丙二醇的产量。此外，当将有机酸作为中间代谢物添加到产生1，2-丙二醇的培养基中时，可以进一步提高1，2-丙二醇的产量。专利技术方式本专利技术提供一种通过在需氧条件下将肺炎克雷伯氏菌培养在包含常见糖碳源的培养基中产生1，2-丙二醇的高效方法。按照本专利技术的一方面，提供一种产生1，2-丙二醇的方法，所述方法包括将肺炎克雷伯氏菌在需氧条件下培养在包含10-30g/L的糖碳源的培养基中，所述糖碳源不包括6-脱氧己糖；和(b)从培养物中分离1，2-丙二醇。按照本专利技术实施方案产生1，2-丙二醇的高效方法包括在需氧条件下，将肺炎克雷伯氏菌培养在包含糖碳源的培养基中，所述糖碳源不包括6-脱氧已糖；和从培养物中分离1，2-丙二醇。肺炎克雷伯氏菌可以是登记号为ATCC 25955的菌株。使用常用方法，例如，离子交换层析、高效液相色谱(HPLC)和结晶法可以从培养物中分离1，2-丙二醇。或者，培养基还可以包含有机酸作为中间代谢物。有机酸中间代谢物可以是，但不限于，选自由丙酮酸、延胡索酸、柠檬酸和琥珀酸组成的组中。对于分批培养，所有的有机酸中间代谢物可以在培养的起始阶段添加到培养基中，而在补料分批培养或连续培养中，可以在培养过程中将有机酸中间代谢物连续或间歇地添加。按照本专利技术，糖碳源包括，但不限于，通常可得的糖，诸如选自由阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、木糖和前述的糖的组合组成的组中的糖。换言之，使用在本专利技术中的糖碳源不包括6-脱氧已糖，诸如鼠李糖和岩藻糖。优选的糖碳源的实例是葡萄糖。在本专利技术中，优选的是根据细胞代谢速度，在预定时期内将培养基中的糖碳源的含量维持在过量。例如，糖碳源的量可以在10-30g/L，优选地10-20g/L的范围内。如果是葡萄糖，糖碳源的量可以在，最优选地10-30g/L的范围内。如果糖碳源的量高于30g/L或低于10g/L，1，2-丙二醇的产量较低。在本专利技术的一个实施方案中，培养基可以每升包含5-15g的Na2HP4，3-8g的KH2PO4，0.5-4g的NH4Cl，2-7g的NaCl，3-10g的酵母提取物，0.1-3mmol的MgSO4，和10-30g的葡萄糖。可以在30-37℃的温度和pH 5-8的条件下进行肺炎克雷伯氏菌的培养。在培养过程中，可以补充一定量的氧以提供需氧条件。例如，可以通过一般已知的供氧方法，例如通过摇动培养器、使用搅拌器来搅拌或注入空气来供给氧。可以在0-1vvm来供给氧。工业适用性如上所述，在按照本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产１，２－丙二醇的方法，所述方法包括：（ａ）将肺炎克雷伯氏菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）于需氧条件下，培养在包含１０－３０ｇ／Ｌ的糖碳源的培养基中，所述糖碳源不包括６－脱氧已糖；和（ｂ）从所述培养物 中分离１，２－丙二醇。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：朴英薰，郑珍守，赵光命，姜声旭，严惠媛，
申请(专利权)人：CJ株式会社，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]