使用单个抗原特异性B淋巴细胞制备产生抗原特异性抗体的杂交瘤的方法以及单克隆抗体的?技术

本发明专利技术提供使用单个抗原特异性Ｂ淋巴细胞制备产生抗原特异性抗体的杂交瘤的方法和单克隆抗体的制备方法。制备产生抗原特异性抗体的杂交瘤的方法包含：选择１个与某种抗原特异性反应的Ｂ淋巴细胞（抗原特异性Ｂ淋巴细胞），对所选择的抗原特异性Ｂ淋巴细胞进行培养，使培养增殖的抗原特异性Ｂ淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤。使用由该方法制备的杂交瘤制备单克隆抗体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及使用单个抗原特异性B淋巴细胞制备产生抗原特异性抗体的杂交瘤的方法以及单克隆抗体的制备方法。
技术介绍
一直以来，为了制备单克隆抗体，要制备产生抗原特异性抗体的杂交瘤。以往的杂交瘤的制备方法中，在制备杂交瘤后，要对产生抗原特异性抗体的杂交瘤克隆进行筛选。但是，杂交瘤的制备并不能高效地进行。也就是说，不是所有的B淋巴细胞都可生成杂交瘤，仅是与骨髓瘤发生细胞融合的B淋巴细胞的一部分生成杂交瘤。另外，即使使用通过抗原刺激的脾细胞制备杂交瘤，也不是只得到产生抗原特异性抗体的杂交瘤，所得杂交瘤的大部分都是生产无关的抗体，而不生产所需抗体本身。例如，根据以往的方法来发现生产目标抗体的杂交瘤时，要使用从免疫小鼠中挑取的脾细胞，与骨髓瘤进行细胞融合，铺10片左右的96孔板。也可以使用全部细胞铺更多的板，但一个人进行筛选时有时间的限制，余下的要通过冷冻等保存。由该方法通常有约500个孔的杂交瘤可增殖。但是，来自500个孔的杂交瘤并不是完全以相同的速度进行增殖，有增殖快的，也有增殖慢的。因此无法同时检查全部500个杂交瘤的增殖。首先要在显微镜下检查哪一个孔的细胞增殖了，还要检查是否增殖到适合检查抗体的细胞数。在此基础上还要由适当的孔中采集细胞上清，检查是否生产了抗原特异性抗体。所述细胞的检查和细胞上清的检查必须尽快地进行。这是由于杂交瘤不断增殖，如果放置不管，则过度增殖，培养基的营养状态恶化，发生死亡。因此必须在所需杂交瘤死亡之前结束筛选。另外，如果发现了目标杂交瘤进行了增殖的孔时，该孔通常除产生目标抗体的杂交瘤之外，还常有产生其他抗体的杂交瘤增殖。还有，杂交瘤是一边缺失杂交瘤自身的染色体一边进行增殖，因此产生了抗体的杂交瘤由于丧失抗体的染色体而可能不再制备抗体。这样的细胞的增殖通常大多比产生抗体的杂交瘤还快，放置不管，则培养的大部分细胞都是不产生抗体的细胞。因此如果发现了所需杂交瘤增殖的孔，必须立即将该孔的细胞以一个孔中一个细胞地重新铺于96孔板中(有限稀释法)，再次重新筛选产生所需抗体的杂交瘤(二次筛选)。检出目标杂交瘤后，必须迅速地、在状态没有恶化之前结束二次筛选。如上所述，由于不会对所有制备的杂交瘤进行筛选，而只使用一部分进行筛选，因此对于出现率低的产生抗原特异性抗体的杂交瘤则难以获得。更具体地说，当为人的抗原特异性抗体时，有用EB病毒转化末梢血B淋巴细胞，形成细胞株，然后对生产抗原特异性抗体的细胞进行筛选的方法(淋巴球机能检索法(修订5版)矢田纯一、藤原道夫编著、中外医学社、1994年；“EB病毒转化B细胞在人单克隆抗体制备中的应用”水野文雄、大里外誉郎、381-391页)。该方法中，可建立的淋巴细胞细胞株的出现率低，因此可得到产生抗原特异性抗体的B淋巴细胞株的概率非常低。另外，细胞株的建立需要花费1个月左右的时间。并且所建立的B淋巴细胞细胞株所生产的抗体量少。采用小鼠时，可以制备杂交瘤，但为人时，尚未制成高效的杂交瘤体系。为小鼠时可以制备杂交瘤。以往，杂交瘤的制备采用以下方法用抗原免疫小鼠，由该小鼠摘取脾脏或淋巴结，制备淋巴细胞，用聚乙二醇或者施加电压，使制备的约108个淋巴细胞与约107个骨髓瘤细胞融合，在HAT等选择培养基上培养，使用ELISA、流式细胞仪等，对增殖的杂交瘤是否生产了特异性抗体进行筛选，选择产生抗原特异性抗体的杂交瘤(淋巴球机能检索法(修订5版)矢田纯一、藤原道夫编著、中外医学社、1994年；“通过B细胞杂交瘤进行的单克隆抗体的制备方法”成内秀夫、574-576页；“Monoclnal antibodies in”AntibodiesA Laboratory Manual”、Harlow和David Lane编著，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，139-244页，1988)。通过采用该方法，可以有300-400孔增殖杂交瘤，但其中生产抗原特异性抗体得杂交瘤发生增殖的孔数为几个百分比。该数目随所使用的抗原而不同，但当产生抗原特异性抗体的B淋巴细胞的出现率低时，难以通过该方法制备杂交瘤。因此，本专利技术的目的在于提供不管是出现率较高的抗原特异性淋巴细胞，还是出现率低的抗原特异性淋巴细胞，都可简便地选择与特定抗原特异性反应的淋巴细胞，由该选择的抗原特异性B淋巴细胞制备产生抗原特异性抗体的杂交瘤的方法。本专利技术还提供由所制备的产生抗原特异性抗体的杂交瘤制备单克隆抗体的方法。
技术实现思路
本专利技术涉及制备产生抗原特异性抗体的杂交瘤的方法，该方法包含选择单个与某种抗原特异性反应的B淋巴细胞(以下成为抗原特异性B淋巴细胞)，对所选择的抗原特异性B淋巴细胞进行培养，使培养增殖的抗原特异性B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤。上述制备方法中，上述选择的抗原特异性B淋巴细胞的培养在抗CD40抗体或CD40配体(CD40L)以及包括白细胞介素4(IL-4)的白细胞介素共存下进行；上述选择的抗原特异性B淋巴细胞的培养在可使B淋巴细胞增殖的促细胞分裂原(例如LPS等)共存下进行；或上述选择的抗原特异性B淋巴细胞的培养在抗CD40抗体或CD40L以及包含IL-4的白细胞介素和促细胞分裂原(例如LPS等)共存下进行；上述单个抗原特异性淋巴细胞的选择使用流式细胞仪或微孔板阵列芯片进行；上述单个抗原特异性淋巴细胞的选择如下进行向抗原特异性淋巴细胞检测用微孔板阵列芯片的各微孔中添加抗原，然后检出与抗原反应的淋巴细胞，从微孔中挑取检出的抗原特异性淋巴细胞，其中上述微孔板阵列芯片中具有多个含单个受检淋巴细胞的微孔；以及抗原特异性淋巴细胞的出现率可为0.1％或以下。本专利技术还涉及使用由上述本专利技术的方法制备的杂交瘤制备单克隆抗体的方法。附图简述附图说明图1是通过使用Ca离子依赖性荧光染料来测定细胞内Ca离子的浓度变化的方法说明图。图2是使用荧光染料的方法中，对于向微孔板阵列芯片进行细胞分注、抗原刺激、挑取操作的说明图。图3是通过ELISA测定OVA免疫的小鼠血清中抗OVA抗体的结果。图4是通过ELISA测定用本专利技术的方法建立的产生OVA特异性抗体的杂交瘤培养上清中的抗体的结果。实施专利技术的最佳方案血液中的淋巴细胞每一个分别与抗原反应。因此，本专利技术中，检测与抗原特异性反应的B淋巴细胞，由该B淋巴细胞制备杂交瘤。以往的杂交瘤制备中，由免疫小鼠制备的脾细胞不经任何处理，直接与骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤，生产抗原特异性抗体，或者在杂交瘤增殖之后开始研究。与此相对，本专利技术的方法中，首先检测并采集制备抗原特异性抗体的B淋巴细胞，使用所采集的抗原特异性B淋巴细胞制备杂交瘤。单个抗原特异性淋巴细胞的选择，例如可使用流式细胞仪或者微孔板阵列芯片进行。使用流式细胞仪进行的单个抗原特异性淋巴细胞的选择可通过常规方法进行。使用微孔板阵列芯片的方法例如可如下进行例如向抗原特异性淋巴细胞检测用微孔板阵列芯片的各微孔中添加抗原，然后检出与抗原反应的淋巴细胞，从微孔中挑取检出的抗原特异性淋巴细胞，由此得到单个抗原特异性淋巴细胞，其中上述微孔板阵列芯片中具有多个含有单个受检淋巴细胞的微孔。以下对该方法进行更具体的说明。(微孔板阵列芯片)微孔板阵列芯片可使用具有多个微孔、且各微孔可含有本文档来自技高网...

【技术保护点】
产生抗原特异性抗体的杂交瘤的制备方法，该方法包括：选择单个与某种抗原特异性反应的Ｂ淋巴细胞（以下称为抗原特异性Ｂ淋巴细胞），对所选择的抗原特异性Ｂ淋巴细胞进行培养，使培养增殖的抗原特异性Ｂ淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：村口笃，岸裕幸，民谷荣一，铃木正康，东保喜八郎，上野实，中里博吉，
申请(专利权)人：财团法人富山县新世纪产业机构，村口笃，岸裕幸，民谷荣一，铃木正康，
类型：发明
国别省市：JP[日本]