编码人胆碱乙酰转移酶或其融合蛋白的核酸序列及其用途制造技术

本发明专利技术属于生物医药领域，涉及一种编码人胆碱乙酰转移酶或其融合蛋白的核酸序列及其用途。本发明专利技术还涉及含有该核酸序列的重组载体、含有该重组载体的重组宿主细胞以及一种制备转导肽‑人源胆碱乙酰基转移酶融合蛋白的方法。本发明专利技术的核酸序列能够高效地表达人胆碱乙酰转移酶或其融合蛋白，蛋白活性高，能够应用于制备治疗肌无力、提高抗疲劳能力或增强运动能力的药物。

Nucleic acid sequence of human choline acetyltransferase or its fusion protein and its use

The invention belongs to the field of biological medicine, and relates to a nucleic acid sequence of human choline acetyltransferase or its fusion protein and its use. The invention also relates to a recombinant host cell, recombinant vector containing the nucleic acid sequences containing the recombinant vector and a preparation transduction peptide human choline acetyltransferase enzyme fusion protein. The nucleic acid sequence of the invention can be highly effective on the surface of human choline acetyltransferase or its fusion protein, and its protein activity is high. It can be applied to the preparation of drugs for treating muscle weakness, improving fatigue resistance and enhancing exercise ability.

【技术实现步骤摘要】
编码人胆碱乙酰转移酶或其融合蛋白的核酸序列及其用途
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种编码人胆碱乙酰转移酶或其融合蛋白的核酸序列及其用途。本专利技术还涉及含有该核酸序列的重组载体、含有该重组载体的重组宿主细胞以及一种制备转导肽-人源胆碱乙酰基转移酶融合蛋白的方法。
技术介绍
1943年发现胆碱乙酰转移酶(CholineAcetyltransferase，ChAT，EC2.3.1.6)，是神经递质乙酰胆碱(Acetylcholine，ACh)的生物合成酶(NachmansohnD,MachadoAL.Theformationofacetylcholine.Anewenzyme:Cholineacetylase.JNeurophysiol.1943；6:397-403)，特异性反应胆碱能神经元功能状态，也是胆碱能神经系统的标志酶。ACh是第一个被确定的神经递质(LoewiO.PflugersArchGesamtePhyiol,1921，189:239-242)，ChAT作为ACh的合成酶，其与ACh的分布颇为一致。ChAT与ACh广泛地存在于外周和中枢神经系统。在外周神经系统中，ACh是副交感神经的节前和节后纤维，以及交感神经的节前纤维和躯体运动神经纤维的神经递质。在中枢神经系统中，ChAT与ACh在脑内分布广泛，脊髓前角运动神经元、丘脑特异性感觉传入通路第三级神经元、脑干网状结构上行激动系统的各个环节、大脑皮质内、边缘系统内、基底神经节尾状核均属于或存在着胆碱能神经元。由胆碱能神经元发出的纤维广泛投射到中枢神经系统多个部位，主要包括胆碱能躯体运动和内脏运动系统；胆碱能脑干网状结构上行激动系统；胆碱能大脑皮质和边缘系统以及胆碱能小脑系统。通过在神经肌肉接头的ACh囊泡量子释放，将中枢和脊髓的运动指令传递到运动单元肌细胞，对于肌肉的力量生成是必需的，因此神经肌肉接头也是肌无力和运动性疲劳产生的一个重要位点。疲劳是一个的世界性的难题。1978年，Edwards将疲劳从起因上区分为中枢性疲劳(定位于中枢神经系统)和周围性疲劳(定位于骨骼肌内部或神经肌肉联结的部位)。Brooks认为，运动性疲劳表现为运动肌工作能力下降，从周围到中枢各个环节都有可能发生，很难孤立地将其完全区分开。胆碱能神经系统除支配机体运动外、与神经精神功能，如学习与记忆，觉醒与睡眠等密切相关。早老性痴呆(AD)病人的基底前脑胆碱能神经元的特异性丢失，肌萎缩性侧索硬化(ALS)和亨廷森氏病也是胆碱能神经元受到影响的神经元退行性疾病，此外精神分裂症及婴儿猝死综合症与胆碱能功能障碍也密切相关。脑内ChAT含量的降低或酶活性的变化直接反应胆碱能神经元功能的变化。因此ChAT与许多胆碱能神经系统疾病密切相关。增加CHAT的表达可促进神经递质Ach的合成，可以有效地改善学习记忆和老年人因Ach分泌不足而引起的各种衰老症状，如老年人胃肠道括约肌、骨骼肌神经肌肉接头及自主神经节前纤维和副交感神经节后纤维Ach释放量的不足导致的老年性肌无力和行动迟缓，及胃液及肠液的反流诱发炎症和癌变，以及性功能低下原因等等。ChAT是分子量为69kD的大分子蛋白，神经细胞合成后，经轴浆转运至突触处生物合成神经递质ACh。但是外源给予ChAT后，ChAT并不能进入靶细胞内，发挥其生理功能。因此需要有可以引导或携带ChAT穿透细胞膜的载体，将外源ChAT引入细胞内。转导肽技术的出现为ChAT蛋白质分子高效通过血脑屏障治疗神经系统疾病，提供了一条有效的新的治疗途径。转导肽是一种能高效穿过生物膜的蛋白转导结构域(ProteinTransductionDomain，PTD)，它能将与其共价连接的多肽、蛋白质及DNA等分子跨膜导入几乎所有的组织和细胞，包括破骨细胞、外周血单核细胞及原代细胞等常规方法难以转染的细胞，甚至还可以穿过血脑屏障(SchwarzeSR,DowdySF,TrendsPharmacolSci.2000,21(2):45-8)。1988年Green(Cell.1988,55:1179-1188)发现HIV的Tat蛋白能够高效地自由的进出细胞。1994年Fawell(ProcNatlAcadSciUSA.1994Jan18；91(2):664-8.)将TAT的36Aa的区域化学交连到异源蛋白上后，交联蛋白也可转导入细胞内。SchwarzeSR,etal.(Science,1999,285:1569-1572.)将TAT的PTD区域短肽与大分子半乳糖苷酶在原核细胞中融合表达后，将融合蛋白在小鼠体内注射，发现有活性的酶分子在体内的各组织中都有表达，尤为重要的是短肽可以携带大分子通过血脑屏障。转导肽是一段富含精氨酸的多肽。TAT能自动跨过细胞膜是由于TAT蛋白上位于47－57(YGRKKRRQRRR)位的一段多肽的作用。除TAT肽外，来自果蝇触角足同源异型转录因子Antp的43-58位的多肽序列(DerossiD,etal.TheJournalofBiologicalchemistry.1996,27(30):18188-18193.)；来自疮疹单病毒DNA结合蛋白VP22的267-300序列(ElliottC,OhareP.Cell.1997,88:223-233)均具有与TAT肽完全相似的转导功能和转导机制，它们也因此被统称为PTD(FordKG,etal.GeneTherapy.2001,8:1-4)。然而，目前人胆碱乙酰转移酶或其融合蛋白的表达困难，容易形成包涵体或者表达量极低。国外文献[Ae-RiKima,AmandaDoherty_Kirbya,GillesLajoiea,R.JaneRylettb.c,BrianH.Shiltona.Twomethodsforlarge-scalepurificationofrecombinanthumancholineacetyltransferasePrareinExpressionandPurification.2005(40):107-117]中ChAT的基因工程表达，主要是在ChAT的N端添加纯化标签，如CBD，6×His等，但表达水平分别为91.5mg/L和66mg/L。因此，尚需要开发更为有效的人胆碱乙酰转移酶或其融合蛋白的制备工艺。
技术实现思路
本专利技术人经过深入的研究和创造性的劳动，发现了一种新的编码人胆碱乙酰转移酶人胆碱乙酰转移酶或其融合蛋白的核酸序列。本专利技术人惊奇地发现，该核酸序列能够高效地表达人胆碱乙酰转移酶或其融合蛋白，其表达量能够达到1g/L甚至1.25g/L，远远高于现有技术；并且产物的酶活性高，蛋白纯度高，生产强度低。由此提供了下述专利技术：本专利技术的一个方面涉及一种分离的核酸序列，其如SEQIDNO:1或SEQIDNO:7所示。本专利技术还涉及一种分离的核酸序列，其由SEQIDNO:1所示核酸序列、转导肽编码序列组成；优选地，其还包含Linker编码序列；优选地，Linker编码序列位于SEQIDNO:1所示核酸序列和转导肽编码序列之间。在本专利技术的一个实施方案中，所述的分离的核酸序列，其中，所述转导肽为反式激活蛋白TAT的PTD序列、果蝇同源异型转录因子ANTP和单纯包疹病毒Ⅰ型VP22转录因子的PTD序本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的核酸序列，其如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7所示。

【技术特征摘要】
1.分离的核酸序列，其如SEQIDNO:1或SEQIDNO:7所示。2.分离的核酸序列，其由SEQIDNO:1所示核酸序列、转导肽编码序列组成；优选地，其还包含Linker编码序列；优选地，Linker编码序列位于SEQIDNO:1所示核酸序列和转导肽编码序列之间。3.根据权利要求2所述的分离的核酸序列，其中，所述转导肽为反式激活蛋白TAT的PTD序列、果蝇同源异型转录因子ANTP和单纯包疹病毒Ⅰ型VP22转录因子的PTD序列或其功能性类似物或片段；优选地，所述转导肽的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示；优选地，所述转导肽的编码序列如SEQIDNO:3所示。4.根据权利要求2所述的分离的核酸序列，其中，所述Linker的氨基酸序列为GGGS、GG或GS；优选地，所述Linker的氨基酸序列如SEQIDNO:6所示；优选地，所述Linker的编码序列如SEQIDNO:5所示。5.一种重组载体，其含有权利要求1至4中任一权利要求所述的分离的核酸序列；优选地，所述重组载体为重组表达载体；优选地，所述重组载体为重组pET15b载体。6.一种重组宿主细胞，其含有权利要求5所述的重组载体；优选地，所述重组宿主细胞为重组的大肠杆菌细胞，例如重组的大肠杆菌BL21细胞。7.一种制备ChAT蛋白或其融合蛋白的方法，包括使用权利要求1至4中任一权利要求所述的分离的核酸序列、权利要求5所述的重组载体或者权利要求6所述的重组宿主细胞表达ChAT蛋白或其融合蛋白的步骤。8.权...

【专利技术属性】
技术研发人员：李前，孙曼霁，任汝通，李梦，李国兴，赵宝全，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11