莱茵衣藻VPS9基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用制造技术

本发明专利技术公开了莱茵衣藻

Application of VPS9 gene in the regulation of Rhine Rhine Chlamydomonas reinhardtii in cadmium tolerance

The present invention discloses Rhine Chlamydomonas

【技术实现步骤摘要】
莱茵衣藻VPS9基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用
本专利技术涉及生物
和污水治理领域，具体涉及莱茵衣藻VPS9基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。
技术介绍
随着社会经济和工业化生产的飞速发展，环境污染问题日趋严重，特别是重金属污染问题。重金属污染的来源有很多，工厂排出的“三废”(废水、废渣和废气)、汽车尾气、农药残留以及人们日常活动中产生的各种生活垃圾和废旧电子产品等均含有重金属，“三废”的超标违规排放以及生活垃圾、废旧电子产品的随意丢弃等极容易造成有毒有害的重金属在土壤、空气和水体中大量积累。而重金属具有长期性和不可降解性，难以被微生物进行降解，能够长时间存在土壤和水体中，随着饮用水和食物链最终会在人体中逐步积累，直接危害人类健康。镉污染是一种常见的重金属污染，主要是随着电镀、冶金、采矿、电池和化学工业等的废水和废渣的排放积累到水体和土壤中。镉不是人体必需元素，正常人的血液中的镉浓度小于5μg/L，尿液中小于1μg/L。镉可以在人体内不断积累，通过与金属硫蛋白形成镉硫蛋白积累到肾脏和肝脏中，影响泌尿系统的正常功能，镉还能够影响骨镉中的钙，造成骨骼严重软化，引起骨痛病，另外镉还可以干扰人体对二价金属元素的吸收，造成铁、铜、锌等元素的缺乏。早在1984年，联合国环境规划署就已经将镉列入具有全球意义的12种危害物之一。目前，对重金属污染的治理主要有物理化学法(化学沉淀法、活性炭吸附法、高分子捕集剂法、溶剂萃取法、离子交换法、膜分离等)和生物法(微生物絮凝法、生物吸附法、植物修复法等)。相比较而言，传统的物理化学法往往成本较高、操作复杂，适合集中处理高浓度的重金属污染区域，如果大面积的使用则容易造成二次污染。而对于大流域、低浓度的重金属污染生物法治理具有更多的优势，不仅投入成本低、操作简单，而且容易避免和减少二次污染的问题。目前，利用微生物进行重金属污水治理成为的研究人员的关注热点，与动植物相比，微生物体积小、表面积大、繁殖快、适应能力强、易于培养等特点，被广泛研究用于重金属污水处理中。能够吸附和代谢重金属的微生物种类很多，主要包括一些工程细菌、真菌和藻类等。藻类是进行重金属污染水体修复的理想生物材料之一，目前被报道的可用于重金属污水治理的藻类种类很多，例如：莱茵衣藻、小球藻、马尾藻、四尾栅藻、团扇藻和螺旋藻等。不同的藻类往往对不同重金属的吸附效果也不同，许多研究表明藻类对多种重金属均有很好吸附能力，可以广泛应用于重金属污染水域的重金属富集回收及水体改造等方面。莱茵衣藻是一种单细胞的真核生物，直径约10μm，细胞质中有一个大型杯状叶绿体，能够进行光合作用，因此被称为“绿色酵母”。在衣藻细胞的顶端具有两根鞭毛，可以游动，在细胞侧面还有可感光的眼点。莱茵衣藻同时具有动物细胞和植物细胞的特征，核基因为单倍体且基因组测序工作也已经完成，更重要的是莱茵衣藻有成熟的遗传转化体系，突变体容易获得，且细胞培养容易，生长速度快，繁殖快，已成为了科学研究的重要模式生物。本专利技术利用电转化法将aphⅧ片段随机插入衣藻中，得到了对氯化镉十分敏感的突变藻株，进一步鉴定得到了与重金属镉耐受性调控相关的基因VPS9及其编码蛋白，可应用于镉污染水域的监控与检测中，为生物法污水中重金属镉的检测与水体改造提供新生物材料，同时也为进一步研究衣藻对重金属镉的耐受机制奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于提供莱茵衣藻VPS9基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。基于VPS9基因调控莱茵衣藻镉耐受性的功能，本专利技术的目的还在于提供莱茵衣藻VPS9基因在降低莱茵衣藻镉耐受性中的应用，提供莱茵衣藻镉敏感型藻株的获得方法以及镉敏感型藻株的应用等。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：本专利技术通过将含巴龙霉素抗性基因的aphⅧ片段随机插入衣藻中得到了对镉显著敏感的莱茵衣藻突变藻株，进一步鉴定发现突变藻株的镉敏感性是由于aphⅧ片段插入到VPS9基因7个内含子中造成的。VPS9基因属于鸟苷酸转换因子，能够促进小G蛋白上的GDP和GTP相互转换。VPS9基因在JGI莱茵衣藻基因数据库中的基因编号是Cre12.g547450，位于莱茵衣藻第12号染色体的8552458-8559307区域，其CDS序列如SEQIDNO:1所示。基于上述发现，本专利技术的目的之一是提供莱茵衣藻VPS9基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。所述VPS9基因的核苷酸序列为下述序列中的一种：(1)包含如SEQIDNO:1所示3483bp的核苷酸序列；(2)包含编码SEQIDNO:2所示蛋白质的核苷酸序列；(3)包含与SEQIDNO:1所示核苷酸序列具有90％以上的同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。所述VPS9基因的编码蛋白为下述蛋白中的一种：(1)包含如SEQIDNO:2所示氨基酸序列；(2)包含由SEQIDNO:2所示氨基酸序列经若干个氨基酸的取代、缺失或者增加等变化且衍生出的具有与SEQIDNO:2所示蛋白相同活性的衍生蛋白。本专利技术的目的之二是提供上述莱茵衣藻VPS9基因在降低莱茵衣藻镉耐受性中的应用。通过降低莱茵衣藻VPS9基因的表达、使VPS9基因失活或缺失VPS9基因来降低莱茵衣藻镉耐受性。本专利技术的目的之三是提供利用上述莱茵衣藻VPS9基因降低莱茵衣藻镉耐受性的方法。所述方法为通过降低莱茵衣藻VPS9基因的表达、使VPS9基因失活或缺失VPS9基因来降低莱茵衣藻镉耐受性。本专利技术的目的之四是提供一种莱茵衣藻镉敏感型藻株。所述镉敏感型藻株为不含VPS9基因活性的VPS9基因突变株或VPS9基因缺失株，或VPS9基因表达下降的VPS9基因表达缺陷株。本专利技术的目的之五是提供一种莱茵衣藻敏感型藻株的获得方法。所述获得方法包括：通过插入突变或者定点突变的方法获得莱茵衣藻VPS9基因突变株，通过构建Crispr载体进而获得莱茵衣藻VPS9基因缺失株，通过构建RNAi干涉载体进而获得莱茵衣藻VPS9基因表达缺陷株。本专利技术的目的之六是提供上述莱茵衣藻镉敏感型藻株在重金属镉污染的监测、检测中的应用。根据莱茵衣藻的VPS9基因表达缺陷株、VPS9基因突变株或VPS9基因缺失株对重金属镉的敏感性，只能在较低浓度的含重金属镉的环境中生长的特性，其可应用于镉污染的监测和检测中，尤其可应用于污水中镉的监测和检测中，如所述莱茵衣藻镉敏感型藻株可以监测环境水体中的镉含量是否超标，方便检测环境中镉污染程度并起到预防或者改善环境镉污染。所述莱茵衣藻镉敏感型藻株应用于监控或者检测环境水体中重金属镉污染的状况，为水体中重金属镉的检测、以及生物法处理污水提供一种新的思路与新的材料。同时，研究VPS9基因调控衣藻对重金属镉的耐受性的作用机制，可以进一步为生物法污水治理奠定理论基础。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术发现的VPS9基因及其编码蛋白是一种新的与重金属镉耐受性调控相关的基因及蛋白，目前尚未见相关的研究报道。(2)本专利技术中采用的获得与莱茵衣藻中重金属镉调控相关的基因和突变体的方法简单、技术体系成熟，能够进一步改进和应用到其他的藻类或模式植物中。(3)本专利技术提供的VPS9基因具有插入约2k左右片段(aphⅧ)的插入突变体，突变体表现出了明显的对重金属镉敏感的特性，有利于进一步研究VPS9基因在衣藻重金属镉吸附本文档来自技高网...

【技术保护点】
莱茵衣藻

【技术特征摘要】
1.莱茵衣藻VPS9基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用，其特征在于：所述VPS9基因的核苷酸序列为下述序列中的一种：（1）包含如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；（2）包含编码SEQIDNO:2所示蛋白质的核苷酸序列；（3）包含与SEQIDNO:1所示核苷酸序列具有90%以上的同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述VPS9基因的编码蛋白为下述蛋白中的一种：（1）包含如SEQIDNO:2所示氨基酸序列；（2）包含由SEQIDNO:2所示氨基酸序列经若干个氨基酸的取代、缺失或者增加等变化且衍生出的具有与SEQIDNO:2所示蛋白相同活性的衍生蛋白。3.莱茵衣藻VPS9基因在降低莱茵衣藻镉耐受性中的应用，其特征在于：通过降低莱茵衣藻VPS9基因的表达、使VPS9基因失活或缺失VPS9基因来降低莱茵衣藻...

【专利技术属性】
技术研发人员：李丽丽，章伟雄，李甜甜，方治伟，刘艳玲，魏志新，何苗，李论，
申请(专利权)人：江汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42