新型微生物、麦芽糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶及其制造方法技术

本发明专利技术提供新型类芽孢杆菌属微生物、新型麦芽糖磷酸化酶、以及新型海藻糖磷酸化酶，所述新型类芽孢杆菌属微生物具有生产麦芽糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶的能力；所述新型麦芽糖磷酸化酶仅作用于麦芽糖，对麦芽糖中的α－１，４－吡喃葡萄糖苷键进行可逆性加磷酸分解；所述新型海藻糖磷酸化酶仅作用于海藻糖，对海藻糖中的α－１，４－吡喃葡萄糖苷键进行可逆性加磷酸分解。本发明专利技术还提供上述新型麦芽糖磷酸化酶以及新型海藻糖磷酸化酶的制造方法。与以往的方法相比，采用该制造方法容易获得所述的酶，还能够大幅度地缩短培养时间；所得酶具有较高的温度稳定性，而且两种酶具有几乎相同的最适ｐＨ范围。（*该技术在2024年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及新型微生物、新型酶以及新型酶的制造方法。具体地说，本专利技术涉及具有在以酶法生产海藻糖时所必需的麦芽糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶的生产能力的类芽孢杆菌属新型微生物、由该微生物得到的新型麦芽糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶、编码这些酶的氨基酸序列的基因、以及这些酶的制造方法。
技术介绍
海藻糖有望广泛应用于医药品、化妆品和食品等领域，为了能够进行工业生产以往进行了许多尝试。这些技术可以大致分为以下三类。其一是从能够将海藻糖蓄积于菌体内的微生物中提取并精制该物质的方法(例如，参照J.Am.Chem.Soc.72卷，2059页，1950年；德国专利第266584号公报；特开平3-130084号公报；特开平5-91890号公报；特开平5-184353号公报及特开平5-292986号公报)。该方法包括微生物的培养工序、分离工序、从微生物中提取海藻糖的工序、提取的海藻糖的精制结晶工序，海藻糖的制造工序相当复杂。并且，不仅海藻糖的生产率低，而且作为废弃物还产生了大量的微生物提取残渣，所以不能称为经济效率较好的方法。并且，还开发了生产海藻糖的发酵法(例如，参照特开平5-211882号公报)，该方法中，培养短杆菌属(Brevibacterium)和棒杆菌属(Corynebacterium)等的微生物作为在菌体外生产海藻糖的微生物。然而在此方法中，海藻糖在培养基中的蓄积率较低，仅为约3％(w/v)，为了在工业上大量生产海藻糖，需要有大容积的发酵罐及与之规模相称的精制设备，因此在经济方面存在问题。而且，在此方法中为了得到精制的海藻糖不仅需要进行除菌操作，而且还需要除去培养时由使用菌株产生的夹杂物或培养基成分等的繁杂工序。另一方面，为了解决这些发酵法中存在的各种问题还开发了酶法。即，在磷酸存在下将来源于微生物的麦芽糖磷酸化酶(麦芽糖正磷酸盐β-D-葡萄糖基转移酶)和来源于藻类的海藻糖磷酸化酶(α，α-海藻糖正磷酸盐β-D-葡萄糖基转移酶)作用于麦芽糖生产海藻糖的方法(例如，参照日本专利第1513517号公报；Agric.Biol.Chem.，49卷，2113页，1985年)，和在磷酸存在下将来源于细菌的蔗糖磷酸化酶(蔗糖正磷酸盐β-D-葡萄糖基转移酶)和来源于担子菌的海藻糖磷酸化酶(α，α-海藻糖正磷酸盐β-D-葡萄糖基转移酶)作用于蔗糖得到海藻糖的方法(例如，参照平成6年日本农艺化学会大会讲演摘要集3Ra14)。按照这些方法能够从麦芽糖或蔗糖以60％～70％的较高收率生成海藻糖。并且，由于使用了精制后的高纯度糖作为原料，所以通过酶反应得到的海藻糖也易于精制，与其他方法相比，这种方法被认为是工业上有用的方法。然而，在这些方法中所使用的酶，特别是海藻糖磷酸化酶的来源仅限于眼虫藻(Euglena)或舞茸(Grifola ffondosa)那样的藻类或担子菌，为了稳定地生产酶不仅在经济方面存在问题，在技术方面也有困难。并且，得到的海藻糖磷酸化酶、与其配合使用的蔗糖磷酸化酶、麦芽糖磷酸化酶的各自最适pH范围差异较大，而且对温度的稳定性也很低，只能在25℃～37℃的低温条件下进行海藻糖的生成反应。这样存在的问题是，不仅在配合使用两种酶时使pH的控制变得困难，而且由于反应温度低，在使用开放型的反应槽进行酶反应时会引起杂菌的污染，为了防止由此带来的副反应还需要有严格的卫生管理。并且，配合使用这些公知的酶时，由于这些酶具有底物浓度依赖性，因而无法使用高浓度的原料。因此，这些方法也不能被称为经济效率好的方法。另外，还发表了以淀粉分解物作为底物制造海藻糖的方法。按照该方法，将用于生成末端具有海藻糖结构的非还原糖的麦芽寡糖基海藻糖生成酶(Maltooligosyl-Trehalose synthase)、和用于从该非还原糖中特异性游离出海藻糖的海藻糖游离酶作用于淀粉分解物，以80％的高收率由淀粉生成海藻糖(例如，参照特开平7-143876号公报；欧洲专利申请628630A2号说明书；日本农艺化学会讲演摘要集，p31(1995))。然而，在此方法中由于使用淀粉作为底物，难以使所述酶固定化并流过底物，反应器等的进一步制造难以简单化和效率化。并且，对海藻糖结晶化后得到的分蜜液进行再糖化的工序也难以构筑。由上所述，只要能够发现制造和精制简便、具有较高的热稳定性且没有底物浓度依赖性的新型麦芽糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶，就有望以能够简单大量得到的麦芽糖为原料高收率简单高效地制造海藻糖。于是，本专利技术的第一目的在于解决所述以往技术中的各种问题，提供能够高效生产麦芽糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶的新型微生物，所述麦芽糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶是能够满足上述各种要求的新型酶。本专利技术的第二目的在于提供制造和精制简便、具有较高的热稳定性且没有底物浓度依赖性的新型麦芽糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶。并且本专利技术的第三目的在于提供麦芽糖磷酸化酶和/或海藻糖磷酸化酶的制造方法，在该方法中，使用所述微生物能够简便高效地得到上述两种酶。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人为了得到具有能够生产下述酶的能力的微生物在自然界进行了广泛的检索，该酶具有能够用于工业生产的麦芽糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶所具备的上述诸多性质。结果发现类芽孢杆菌属微生物能够大量生产具备所述条件的两种酶，从而完成了本专利技术。即，本专利技术的摘要为如下所述内容。(1)本专利技术提供具有能够生产麦芽糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶的能力的类芽孢杆菌属微生物，具体地说是提供保藏号为FERM BP-8420的类芽孢杆菌sp.SH-55(paenibacillus sp.SH-55)。(2)本专利技术提供具有以下所示理化性质的麦芽糖磷酸化酶。(I)作用对麦芽糖中的α-1，4-吡喃葡萄糖苷键进行可逆性加磷酸分解，生成葡萄糖和β-D-葡萄糖1-磷酸；(II)底物特异性(分解反应)作用于麦芽糖，但不作用于海藻糖、蔗糖、乳糖和纤维二糖等； (III)作用pH的范围、最适pH及稳定pH范围作用pH的范围为4.5～9.5；分解反应的最适pH为7.0～8.0，合成反应的最适pH为5.5～6.5；于50℃加热10分钟的加热条件下，在pH5.5～7.5的范围内稳定；(IV)作用温度的范围和最适温度作用温度范围为20℃～60℃；分解反应的最适温度在45℃～55℃附近，合成反应的最适温度为50℃～55℃；(V)温度稳定性在pH6.0加热15分钟的加热条件下，于50℃或50℃以下极其稳定；于70℃完全失活；(VI)抑制剂受铜、汞、N-溴代琥珀酰亚胺、对氯汞安息香酸(各为1mM)、十二烷基苯磺酸钠(1％)的抑制；(VII)等电点在pH4.8～5.0的范围内；(VIII)以SDS-聚丙烯酰胺电泳法测定的分子量约为89000～90000道尔顿，以凝胶过滤法测定的分子量约为190000道尔顿；该麦芽糖磷酸化酶由同型二聚物构成。(3)本专利技术提供如所述(2)记载的麦芽糖磷酸化酶，其具有下述氨基酸序列以序列号1所表示的氨基酸序列、或序列号1所表示的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸缺失、取代、倒置、增加或插入的序列。(4)本专利技术提供如所述(2)记载的麦芽糖磷酸化酶，其所具有的氨基酸序列与以序列号1所表示的氨基酸序列具有大于或等于52％的同源性，优选具有大于或等于70％的同源性，更优选具本文档来自技高网...

【技术保护点】
类芽孢杆菌属微生物，其具有生产麦芽糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶的能力。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：日高祐子，秦田勇二，伊藤进，掘越弘毅，吉田雅浩，中村信之，高田正保，中久喜辉夫，
申请(专利权)人：独立行政法人海洋研究开发机构，日本食品化工株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]