一种改进的重叠延伸PCR方法及其所获得的突变基因技术

本发明专利技术涉及基因定点突变的方法，具体的说是一种改进的重叠延伸ＰＣＲ方法及其所获得的突变基因，本方法分为如下步骤：片段合成；双混合；预延伸；全长ＤＮＡ合成；后延伸。以来自于酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）的腺苷蛋氨酸（ＳＡＭ）合成酶基因ｓａｍｌ为起始基因验证了该方法的有效性，并获得了经稀有密码子改造的突变基因，该基因编码的ＳＡＭ合成酶能在酿酒酵母中高效表达，并且能提高胞内ＳＡＭ的积累量。本发明专利技术在原有重叠延伸ＰＣＲ的基础上，进行了一系列重要的改进，使得在一个反应过程中实现多点定位突变。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种改进的重叠延伸ＰＣＲ方法，其特征在于：反应过程分为以下几个步骤：（１）片段合成：以所需突变的全长基因为模板，根据突变位点的个数设计一系列平行引物，引物中包含待突变的碱基，每相邻一对引物的末端设计一个重叠区段，长度为２０－ ３０ｂｐ；采用上述每相邻的一对引物分别进行平行的ＰＣＲ，实现各个ＤＮＡ小片段的扩增；（２）双混合：分别纯化上述片段，分成不同组分，将等量相邻的ＤＮＡ片段分别两两混合，片段之间互为模板，以重叠延伸ＰＣＲ方式扩增成长片段，反应为无引物Ｐ ＣＲ过程；（３）预延伸：将上述多组反应后产物混合在一起，新形成的长片段之间互为模板，以重叠延伸ＰＣＲ方式扩增成全长新模板，该步骤也是无引物ＰＣＲ过程；（４）全长ＤＮＡ合成：在上述反应体系中加入全长基因的一对外侧引物，以上一步 产生的重组全长ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增出全长基因；（５）后延伸：将上述反应体系再经过１０个循环的９４℃变性３０ｓ，７２℃退火和延伸１ｍｉｎ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴文芳，安迎锋，吕安国，
申请(专利权)人：中国科学院沈阳应用生态研究所，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]