Ｌ－氨基酸酰胺不对称水解酶及其编码ＤＮＡ制造技术

本发明专利技术通过导入编码酶的ＤＮＡ生产重组微生物，所述酶水解Ｌ－氨基酸酰胺，尤其是Ｌ－２－烷基半胱氨酸酰胺的酰胺键，以及利用所获得的微生物的细胞或细胞处理产物生产Ｌ－氨基酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及新的L-氨基酸酰胺不对称水解酶和其编码DNA，以及其用途。更具体地，本专利技术涉及新的酶，所述酶具有至少立体选择性水解L-氨基酸酰胺，尤其是L-2-烷基半胱氨酸酰胺(L-2-alkylcysteine amide)的酰胺键的活性；编码所述酶蛋白的DNA；其中已引入了所述DNA的重组微生物；利用所述重组微生物显著提高酶的培养物生产率的方法，以及利用所获得的酶有效地将L-氨基酸酰胺转变为L-氨基酸的方法。光学活性氨基酸和氨基酸酰胺，尤其是光学活性2-烷基半胱氨酸和2-烷基半胱氨酸酰胺是用作多种工业化学品、药物、和农业化学品的生产中间体的重要原料。
技术介绍
作为从氨基酸酰胺生产光学活性氨基酸的方法，例如，包括利用微生物或这种微生物的细胞处理产物的方法被称为工业上有益的方法，所述微生物含有立体选择性不对称地水解外消旋的氨基酸酰胺的酰胺键的酶(专利文献1和2)。这种作为源于活体的催化剂的酶具有极好的特征，其允许在温和反应条件下以极高的反应特异性生产目标产物。然而，其可催化的底物类型是有限的，并且由于细胞生产的酶量少因而反应需要大量的细胞，因此，由于其经济上的劣势，存在所述方法不能使用的技术问题。因此，为了增加具有上述活性的酶的生产量，已试图通过基因重组技术克隆编码酶蛋白的DNA来制备转化体，所述酶立体选择性地水解氨基酸酰胺，然后利用所述转化体由外消旋的氨基酸酰胺生产光学活性氨基酸(专利文献3至8和非专利文献1)。例如，专利文献3公开了来自贪噬菌属(Variovorax)的D-酰胺酶、编码所述D-酰胺酶的DNA、均含有这种核酸的质粒、载体和微生物、与所述核酸杂交的核酸、用于生产所述核酸的引物等等。专利文献4公开了修饰的氨基酸酰胺酶和利用所述修饰的氨基酸酰胺酶生产D-氨基酸的方法。然而，这些方法只能对D-氨基酸酰胺起作用，因此L-氨基酸酰胺不能通过所述方法水解。另一方面，作为作用于L-氨基酸酰胺的酶的例子，专利文献5公开了立体选择性水解L-氨基酸酰胺的酰胺键的酶，其源自产氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)，以及编码所述酶的DNA。所述酶对L-脯氨酸酰胺有高活性，但对其它L-氨基酸酰胺具有低活性。此外，专利文献6公开了源于食酸丛毛单胞菌(Comamonas acidovorans)的酶蛋白和编码所述蛋白质的DNA，以及利用所述酶蛋白生产光学活性有机酸的方法。专利文献6也公开了氨基酸酰胺的不对称水解(asymmetrichydrolysis)，其中只有亮氨酸酰胺和苯丙氨酸酰胺用作底物。还有，专利文献7公开了具有立体选择性水解α-氨基酸酰胺和α-羟基酸酰胺(α-hydroxylic acidamide)的酰胺酶活性的蛋白质以及编码所述蛋白质的DNA。然而，只公开了叔-亮氨酸酰胺作为优选的氨基酸酰胺底物。另外，专利文献8公开了获得含肽酰胺酶的微生物的方法、由所述方法获得的微生物、包含在所述微生物中的肽酰胺酶、和使用它们的方法。此酶对二肽酰胺、N-乙酰氨基酸酰胺、或受保护的氨基酸酰胺具有高活性，而不具有水解未保护的氨基酸酰胺的活性。更进一步，非专利文献1公开了立体选择性水解在α位置具有烷基的氨基酸酰胺的酶。然而，其中公开的例子限于具有碳氢化合物型侧链的氨基酸如甲基缬氨酸、甲基亮氨酸、和甲基苯丙氨酸，根本没有有关在侧链中具有巯基和烷基的2-烷基半胱氨酸的描述。2-烷基半胱氨酸是烷基半胱氨酸的衍生物，其为非典型氨基酸，不同于典型的天然氨基酸，在α位置的碳原子上具有烷基并且在其分子中有多个反应性取代基，包括巯基、氨基和羧基。特别地，2-烷基半胱氨酸的光学活性形式是预期广泛用作多种工业化学品、药物、农业化学品等等的生产原料或一般手性结构单元(general chiral building block)的化合物，从工业的观点来说也是极为有用的，因此一直希望开发其工业上有益的且廉价的生产方法。然而，如上所述，具有立体选择性地水解L-2-烷基半胱氨酸酰胺中的酰胺键活性的酶仍然是未知的，因此，利用这样的酶生产光学活性2-烷基半胱氨酸或光学活性2-烷基半胱氨酸酰胺的方法也是未知的。此外，对于L-氨基酸酰胺水解酶和有效地生产和利用该酶的方法一直存在需求，所述的L-氨基酸酰胺水解酶是高活性和高立体选择性的，且对其它L-氨基酸酰胺具有广泛的底物谱，以便可以应用于用作工业原料的多种氨基酸酰胺。专利文献1JP-A-61-293394专利文献2JP-A-62-55097专利文献3JP-A-2003-225094专利文献4JP-A-2002-253256专利文献5JP-A-2003-250558专利文献6JP-A-08-256771专利文献7WO 00/63354专利文献8日本专利No.3112090非专利文献1H.F.M.Hermes等，Applied and Environmental Microbiology，Vol.60，No.1，p.153-159，1994
技术实现思路
本专利技术的目的是提供L-氨基酸酰胺不对称水解酶、编码该L-氨基酸酰胺不对称水解酶的DNA、重组微生物，其中已导入了包含该DNA的重组DNA、和利用它们生产光学活性氨基酸，尤其是光学活性2-烷基半胱氨酸的方法，上述所有均可优选用于生产光学活性氨基酸，尤其是光学活性2-烷基半胱氨酸，其为工业上有用的化合物，预期将广泛用作多种工业化学品、药物、和农业化学品的生产中间体。本专利技术的专利技术人进行了深入的研究，以解决上述问题，结果发现了具有高的立体选择性地水解L-氨基酸酰胺尤其是L-2-烷基半胱氨酸酰胺中的酰胺键的酶活性的微生物，并且首次从所获得的微生物分离并纯化了显示上述催化活性的酶。此外，本专利技术的专利技术人首次分离并获得了编码该酶的DNA，并成功制备了包含所述DNA的重组DNA和重组微生物，其中所述重组DNA已被导入到重组微生物用于表达。此外，通过培养由此获得的重组微生物，有可能制备具有比野生型菌株明显更高的比活性(specific activity)的细胞或酶溶液，以非常有效地将L-氨基酸酰胺尤其是L-2-烷基半胱氨酸酰胺转变为相应的L-2-烷基半胱氨酸，所述野生型菌株已被用作DNA供体。本专利技术的L-氨基酸酰胺不对称水解酶不仅具有不对称水解L-2-烷基半胱氨酸的活性，还具有非常广泛的底物谱。也就是说，L-氨基酸酰胺不对称水解酶能够不对称地水解相应于天然的典型氨基酸如L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、和L-苯丙氨酸的许多L-氨基酸酰胺，以及相应于所谓的非典型氨基酸如L-2-氨基丁酸、L-叔-亮氨酸、L-苯基甘氨酸、L-对-氯苯基甘氨酸、L-ε-醛基赖氨酸(アリシン)乙二醇缩醛(L-allicin ethylene acetal)、L-青霉胺(L-penicillamine)、和(4R)-5，5-二甲基-1，3-噻唑烷-4-羧酸((4R)-5，5-dimethyl-1，3-thiazolidin-4-carboxylic acid)的L-氨基酸酰胺。如上所述，本专利技术的酶是具有严格的立体特异性和与许多L-氨基酸酰胺反应的特性的新酶，所述的立体特异性选择性地水解L-氨基酸酰胺中的酰胺键，因此它是工业应用中非常出色的并不同于已知酶的酶。也就是说，本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
立体选择性地水解Ｌ－氨基酸酰胺的酰胺键的酶，其中所述酶包含ＳＥＱＩＤＮＯ：８中氨基酸编号１至３５５代表的氨基酸序列，或者包括缺失、取代或添加１个或多个氨基酸的所述氨基酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：浅野泰久，井上敦，
申请(专利权)人：三菱瓦斯化学株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]